非コードRNAを分子基盤とするミトコンドリア病の新規発症機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10060
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 水野 洋介 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30406532)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ミトコンドリア病 / 呼吸鎖酵素 / 非コードRNA / マイクロRNA

Outline of Annual Research Achievements

平成３０年度は前年度に引き続き、特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞用いた実験を行った。ミトコンドリアの分裂や融合、エネルギー産生能やストレス制御に関わるDNM1L、MFN2、p32等の遺伝子の機能が欠損・抑制された細胞では、ミトコンドリアの伸展、分裂、融合等の形態変化やエネルギー産生能の低下を生じる。こうした細胞ではミトコンドリア機能に関わる非コードRNAの発現量にも大きな変化が生じていると考えられる。このような非コードRNAを同定するため、ヒト培養細胞を用いてDNM1L, MFN2, p32遺伝子をRNA干渉法によりノックダウン、もしくはCRISPRシステムによりノックアウトした細胞からミトコンドリアおよびミトコンドリア内膜内成分（マイトプラスト）を分画して全RNAを抽出した。ミトコンドリア関連遺伝子を抑制させたことの効果として、ミトコンドリアの形態が変化していることを確認した。得られたミトコンドリアRNAについて発現アレイを用いてmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現量を定量した結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを検出することが出来た。ミトコンドリアの分裂や融合に関わる遺伝子を抑制することにより、共通して発現が変動する長鎖非コードRNAやマイクロRNAも複数検出することが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられる。引き続き次世代シーケンサーを用いて、詳細な発現解析を行っていきたいと考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成３０年度は十分なノックダウン効率が得られた細胞を用いて発現アレイ解析実験を行い、得られたデータを詳細に解析し、発現変動を示したRNAの検証実験を重点的に進めた。次世代シーケンサーによる未知のRNAを含めた発現解析については、令和元年度に詳細に実行したいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

十分なノックダウン効率が得られた細胞サンプルを用いて、次世代シーケンサーを用いた未知のRNAも含めた詳細な発現解析を行う。発現変動が検出されるmiRNA、mRNAについて、ミトコンドリア機能への関りを検証するための実験を行い、新規の知見として取りまとめたいと考えている。

Causes of Carryover

平成３０年度中に次世代シーケンサーを用いた発現解析実験を行う予定であったが、解析に用いる細胞の質の確保と、これまで得られたデータにおける詳細な解析とその検証実験を行った。十分なノックダウン効率条件下でのデータ解析がある程度出来たため、令和元年度はそれを用いて次世代シーケンサーを用いた未知のRNAも対象にした発現解析を実施し、その検証実験も行って、新規の知見として取りまとめる予定である。