2017 Fiscal Year Research-status Report
脂質メタボローム解析から展開するペルオキシソーム病の病態解明と臨床指標の探索
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17K10062
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 教授 (50246021)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ペルオキシソーム病 / 先天代謝異常症 / 副腎白質ジストロフィー / 脂質メタボローム / リピドミクス / スフィンゴ糖脂質の網羅的解析 / リン脂質の網羅的解析 / 分子種分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ペルオキシソーム病の副腎白質ジストロフィーではABCD1遺伝子の変異に伴い極長鎖脂肪酸レベルが上昇する。１患者サンプルのリン脂質の網羅的解析、２極長鎖脂肪酸含有リン脂質の合成酵素の同定、３患者サンプルのスフィンゴ糖脂質の網羅的解析、の３つについて解析することにより、発症機構の解明と発症のマーカーを探索する事を目的とする。
患者サンプルのリン脂質の網羅的解析では、患者試料に先立ちモデル動物であるABCD1ノックアウトマウスの脳と、モデル細胞としてABCD1遺伝子をノックアウトしたHeLa細胞を材料としてリン脂質の網羅的解析を行った。手法としてはLC-MSのMRMモードを用いて分子種ごとの定量を行い、分子量が大きい分子種はEPIモードを用いた構造解析で脂肪酸の種類と結合位置を特定した。その結果、どちらにおいても極長鎖脂肪酸を含有するホスファチジルコリンとホスファチジルエタノ－ルアミンなどのリン脂質分子種が数十種検出された。これらの多くは、グリセロール１位に飽和または一不飽和の極長鎖脂肪酸を有していた。さらにスフィンゴミエリンと代謝中間体であるアシルCoAについて、LC-MSで網羅的に測定する解析系を構築した。
極長鎖脂肪酸含有リン脂質の合成酵素の同定では、上記のように極長鎖脂肪酸含有リン脂質の発現が確認されたABCD1ノックアウトHeLa細胞を用いて、リン脂質のグリセロール１位に極長鎖脂肪酸を導入する酵素の候補として、各種アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を定量的RT-PCR法で調べた。発現している酵素について順次RNAi法を用いてノックダウンし、細胞のリン脂質を網羅的にメタボローム解析し、極長鎖脂肪酸含有分子種の変動を解析中である。
患者サンプルのスフィンゴ糖脂質の網羅的解析では、患者試料に先立ちABCD1ノックアウトHeLa細胞を用いて、MRM法により定量解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
申請時の計画に比べて、患者サンプルのリン脂質の網羅的解析では、患者サンプルに先立ち実施したノックアウトマウス脳とノックアウト細胞の測定は完了したものの、患者サンプルの解析は倫理委員会の審査も含めて準備が完了したところであり、若干遅れが生じている。
極長鎖脂肪酸含有リン脂質の合成酵素の同定では、ほぼ予定通り定量的RT－PCRによる各種アシルトランスフェラーゼの発現を解析し、RNAi法を用いて順次ノックダウンして、それぞれの細胞におけるリン脂質の網羅的測定を行うことができた。
患者サンプルのスフィンゴ糖脂質の網羅的解析では、患者サンプルに先立ちノックアウト細胞の測定は実施中であるものの、患者サンプルの解析は倫理委員会の審査も含めて準備が完了したところであり、若干遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
若干の遅れは生じているものの、実施に際して問題はなく、今後はほぼ計画通りに推進できる見込みである。
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| Causes of Carryover |
一部進捗が遅れた項目があり、その部分の支出を翌年度に実施することとなった。
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