2019 Fiscal Year Research-status Report
時期特異的Foxc2+間葉系細胞系譜を用いた心血管発生の解析
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17K10063
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
森島 正恵 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (00241068)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森川 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (70339000) [Withdrawn]
北原 秀治 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (40510235)
清水 一彦 東邦大学, 医学部, 助教 (90385394)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝子・先天性疾患 / 遺伝子改変マウス / 細胞系譜 / 心大血管発生 / 肺発生 / Foxc2遺伝子 / 間葉系細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Foxc2遺伝子はフォークヘッド転写因子であり、リンパ浮腫及び心大血管奇形を伴う疾患の原因遺伝子とされている。我々はFoxc2ノックアウト(ＫＯ)マウスの心大血管器系および肺成熟異常との関連について解析を行い、本遺伝子欠失マウスにおいて肺胞上皮の分化異常とリンパ管形成異常見出し、さらに肺形成時における間葉系細胞でのLef1遺伝子発現の低下について報告した。Foxc2遺伝子は発生過程の間葉系細胞のほぼ全てにおいて発現しているため、Tamoxifen (TAM) 誘導性Foxc2-Cre (Foxc2-CreERT2) マウスの分与をうけての解析を試みた。Foxc2-CreERT2マウスがC57BL/6系のため、ICRおよび129ｘBlackSwiss交雑系への戻し交配を行い、2019年度は系統差における表現型の解析が可能な状態となったため、①ICR系、129ｘBlackSwiss交雑系、C57BL/6間の表現型系統差に関連する発生時期の確認、Foxc2欠失時における表現型のスペクトラム変化の解析を行うとともに、②第2心臓野(Secondary Heart Field: SHF)に相当する胎齢10.5日鰓弓部位のRNAシークエンス解析を、ICRと交雑系Foxc2 KOマウスで試行し、それぞれの系統におけるwild, heterozygous, null間の比較を行った。①については、TAM投与において母獣の週齢依存で早産傾向が発現した。このため、20週齢までの母獣で再確認中である。②ではミュータント群の系統間の比較においても発現量に差のある遺伝子が有り、表現型の系統差につながる可能性が示唆されている。
また、ヘテロ個体で眼球脈絡膜毛細血管板の異常個体がいるため、薬物誘発によるモデルを用いて電子顕微鏡的手法による血管板の解析法を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
マウス飼育施設が新設となり、移動に要する凍結胚数を十分に用意するため、実験に使用できる個体数が限られたこと、および所属講座が新設施設に移動するため、研究活動が数ヶ月単位で制限された。また、①の系統差に関連してのFoxc2+細胞系譜解析で、間葉系細胞の遊走がほぼ完了していると仮定していた胎齢11.5日のTAM投与群で、心大血管のFoxc2+細胞の分布域が、従来の報告範囲よりも広い可能性を示唆する結果を得たため、組織学的に詳細な解析が必要となった。②については、Foxc2欠失個体の系統間比較で、発現量が二倍以上変動している遺伝子数が当初の想定よりも多く（ICRでは遺伝子欠失との比較で１８遺伝子だが、遺伝子欠失グループの系統間では79遺伝子）、発現部位確認対象のさらなる検討の必要性が生じている。また、鰓弓組織でのRNA発現では胎齢10.5日マウス胚仔で、既に左右差が生じている結果を得たため、これらの結果をも含んだ検討が必要となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初、Foxc2 CreERT2/―; R26R-LacZ個体を得て、Cre-ERT2; R26R+/+ 胚子を得る効率アップを計ったが、胎仔におけるトリプルミュータント個体は得られるが繁殖可能な成獣が得られず、最終的にFoxc2+/-; (R26R) x Foxc2 -CreERT2; R26R間で交配して、ダブルミュータント胚子・胎仔を得ている。①については、現在、レポーターマウスにR26R-LacZを用いたβーgal染色でシグナルを観察しているため、R26R-Tomatoなど蛍光シグナルを用いた解析に移行していき、系統差発生過程の詳細な観察を行うと同時に、肺の血管と間葉系の分化についても免疫組織学的な手法を用いて解析を進める計画である。また、これら大血管の異常形態と肺実質に関与する間葉系細胞の分布動態の報告がないに等しいため、R26R-confetti マウスを用いたクローン解析も考慮している。②については、まずqPCRで候補遺伝子を絞り込み、免疫染色法を用いて鰓弓器官および肺実質分化を中心に、Foxc2欠失時の遺伝子発現動態の詳細とその部位の特定を進めていく計画である。また、Foxc2ヘテロ個体に散発する感覚器の異常所見についても、組織学的なデータの追加をさらに試みる。
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| Causes of Carryover |
当初より、Foxc2-CreERT2; R26R-LacZマウスの搬入が半年以上遅延したことと、施設の移設により新しいレポーターマウスの計画を一時中断せざるを得なかったことにより、繰り越し分が生じた。新施設への遺伝子改変マウス移動経費および予定していたレポーターマウスの購入と、その解析に必要な試薬の購入に繰り越し分は使用する。
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