Identifying the role of ICA69 in the induction of type 1 diabetes

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10084
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 田嶼 朝子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00328337)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 1型糖尿病 / 自己免疫疾患 / ICA69

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、1型糖尿病（T1D）の自己抗原のひとつであるICA69が、糖尿病ならびにT1Dに併発する他の自己免疫疾患の発症に寄与するかどうかを検討することである。実験には、遺伝子組換えにより作製したICA69ノックアウトNODマウス（ICA-NOD）を用いた。
平成29年度は、研究開始にあたり各実験に用いる器具や試薬を揃え、手技の確認を行いながら、米国ピッツバーグ市、Institute of Cellular Therapeutics、Allegheny Health NetworkからICA-NODマウスを輸入し、繁殖を開始する予定であった。ICA-NODマウスが同研究室外に持ち出されるのは初めてである。適切なマウスの選定ならびに手技の条件確認のために渡米したところ、同研究室におけるICA-NODマウスの繁殖が滞っていることがわかった。実験ならびに繁殖に適当な週令・年齢のマウスが揃うのを待つ必要性があったことや、輸入に際し書類上の手続きに時間を要したことから、実際にマウスを輸入し、飼育および繁殖を開始できたのは平成30年2月であった。さらに輸入した繁殖用の雌ICA-NODマウスが2匹共に高血糖を呈しており、1匹は一度妊娠したものの生まれたマウスは生後数日で死亡、その後、雌マウスは2匹ともに死亡したため繁殖が滞った。
そこで平成30年度は、米国から輸入したICA69ヘテロ欠損型のICA-NODマウス（雄）とT1D自然発症モデルマウスであるNOD/ShiJcl（雌）との交配を開始した。繁殖は順調にすすみ、遺伝子型確認のためのPCR条件が整ったため、ヘテロ欠損型ICA-NODの雌雄の繁殖を早期に開始することができた。そして主に野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型のマウスにおいて、生後8-10週目から2週間毎を目安に血糖測定を行い、糖尿病発症時期を追跡することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成30年度は、まずICA-NOD系統マウスの繁殖を安定させ、野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型ICA-NODマウスを増やすことに最大の努力を払った。生後8-10週目からほぼ2週間に1回、血糖を測定し、糖尿病発症時期を確認した。従来、NODマウスにおける糖尿病発症率は雄より雌においてより高く、その時期は平均18週令である。今年度、われわれのコロニーではICA-NOD野生型の雄12匹、雌5匹、ヘテロ欠損型の雄12匹、雌9匹、ホモ欠損型の雄4匹、雌4匹の計46匹について検討したが、ICA-NOD野生型、ヘテロ欠損型いずれにおいても糖尿病発症率は雌において高率にみられ、発症時期が早かった。さらに、雌雄ともに、ヘテロ欠損型は野生型よりもより早く糖尿病を発症する傾向が示された。ホモ欠損型についても糖尿病発症時期がやや早い傾向が見られるが、サンプル数が少ないため現在検討中である。一方、組織学的評価あるいはRNA抽出を目的とした早い週令での検体の採取は、血糖推移を追跡するマウス数を確保する必要があったために実施しなかった。

Strategy for Future Research Activity

平成31年度は以下について研究をすすめる。
①サンプル数を増やすために引き続きICA-NODマウスの繁殖を続ける。糖尿病発症時期についての検討を進めながら、当初の計画に沿って、生後12週、20週、30週を目安に糖尿病を発症していないマウスから各種検体を採取する。②特に、膵臓、甲状腺、唾液腺はホルマリン液に保存した上でHE染色を行い、リンパ球浸潤の有無を確認し、focus scoreを比較する。③同じ週令の検体を用いてCD45、CD4、CD8、インスリン、グルカゴンに対する免疫組織染色を行う。④各組織から抽出したRNAをcDNAに転写し、リアルタイムPCRでICA69をエンコードするIca1遺伝子の発現を定量化する。これらをハウスキーピング遺伝子の発現量と比較した上で、組織間の差を検討する。
また、昨年度にコントロール検体を用いて手技の確認を行っていた際に、従来用いていたRNA抽出法では十分なRNA量を採取できない可能性があることがわかった。RT-PCR解析においてRNA量は重要な因子の一つである。RNA抽出の手技を安定させるために、新たな器具を導入し、解析を進める予定である。
なお、本年8月に渡米し、ICA-NODマウスの提供を受けた研究室にて得られた結果について意見交換する予定である。

Causes of Carryover

ICA-NODマウスの繁殖開始が遅れ、サンプル数が十分でなかったことから各実験が滞った。そのため、使用予定の試薬や機器、検査の依頼に要する費用が少なかった。
今後マウスのコロニー数をさらに増やし、実験の対象とするマウスの飼育をエンドポイント（糖尿病の発症、あるいは最長32週）まで継続するため、常時、動物施設を利用する必要がある。平成31年度は、研究計画に則って、糖尿病を発症していないICA-NODマウスやコントロールから採取した検体のDNA、RNA抽出を行うほか、免疫組織染色をすすめる。さらに、検体を処理する際に必要な器具や免疫染色に用いる試薬を入手する予定である。