Identifying the role of ICA69 in the induction of type 1 diabetes

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10084
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 田嶼 朝子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00328337)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 1型糖尿病 / 自己免疫 / ICA69 / ノックアウトマウス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、1型糖尿病（T1D）の自己抗原のひとつであるICA69が、糖尿病ならびにT1Dに併発する他の自己免疫疾患の発症に寄与するかどうかを検討することを目的とする。研究対象として、遺伝子組換えにより作製したICA69ノックアウトNOD（ICA-NOD）マウスを用いた。
平成29年度：研究を実行するにあたり米国ピッツバーグ市、Institute of Cellular Therapeutics、Allegheny Health NetworkからICA-NODマウスを輸入し、その繁殖の開始を予定した。しかし、同研究室におけるICA-NODマウスの繁殖が滞っていたこと、輸入の手続きに時間を要したこと等から、実際にマウスを輸入し、飼育および繁殖を開始できたのは平成30年2月と大幅に遅れた。その上、繁殖用の雌ICA-NODマウスは輸入した時点で2匹共に高血糖を呈していた。その後雌マウスがいずれも死亡し、ICA-NOD系統を継続させるための交配方法を新たに検討した。
平成30年度：米国から輸入したICA69ヘテロ欠損型の雄マウスとT1D自然発症モデルマウスであるNOD/ShiJcl（雌）との交配を開始した。同年7月頃から繁殖が順調にすすみ、年度内に69匹のICA-NODマウスが誕生した。遺伝子解析により、生まれたマウスを野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型に判別し、生後8-10週目から2週間毎を目安に血糖を測定して糖尿病発症時期を追跡した。出生数が増え安定してきた平成30年末から組織学的評価やRNA抽出のために胸腺、唾液腺、膵臓、甲状腺を採取し始めた。
平成31年度：これまでの実験を継続した。へテロ欠損型の雌は妊娠しても高血糖になることがあり、生まれた子マウスが脆弱であったり雌が育てられないため、生存するマウスが一時的に停滞した。その結果目標とするサンプル数が揃わず、実験の継続を要した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年度は米国からのICA-NODマウスの輸入が大幅に遅れた。この間、実験開始の準備を万全にすることに努めた。平成30年度から開始したICA-NODマウスの繁殖は概ね順調にすすみ、これまでに約110匹のマウスが出生した。遺伝子解析を終えた83匹のうち、野生型は雄19匹、雌12匹、ヘテロ欠損型は雄20匹、雌23匹、ホモ欠損型は雄4匹、雌5匹であった。これらにおける糖尿病発症時期を検討したところ、ICA-NOD野生型、ヘテロ欠損型いずれにおいても、糖尿病発症率は雄と比較し雌においてより高率であった。また発症時期は、雌は野生型よりもヘテロ欠損型の方が約3週間早かったが、雄は野生型の方が早期に高血糖を呈した。
目的とする実験は野生型、ヘテロ欠損型を主に使用した。ヘテロ欠損型は繁殖にも使用するため、マウスが不足しがちであった。とくに雌においては、元来高血糖になりやすく、妊娠によりさらに糖尿病の発症時期が早期になったり、出産しても死に至ることがあった。そのため実験に用いるヘテロ欠損型が足りず、目標とするサンプル数に至らなかった。一方、野生型からは生後12週、20週のマウスから検体を採取した。HE染色で主に膵臓、甲状腺を観察し、リンパ球浸潤の程度について評価を行っている。なお、RNAレベルでのIca1遺伝子発現量を調べるために、唾液腺、甲状腺、膵臓、胸腺、肝臓、胃を採取し凍結保存した。

Strategy for Future Research Activity

最終年度はICA-NODマウスの繁殖を継続し、引き続き血糖測定を行いながら、糖尿病発症前のマウス（12、20、30週齢）から各種検体を採取する。血糖の推移から野生型、へテロ欠損型、ホモ欠損型各々における糖尿病発症率及び発症時期を比較する。また、膵臓、甲状腺、唾液腺のHE染色において組織中のリンパ球浸潤の程度を評価する。免疫組織染色では各組織におけるCD4陽性、CD8陽性リンパ球の存在やインスリン、ICA69の発現を確認する。各組織から抽出したRNAをcDNAに転写し、リアルタイムPCRを用いてICA69をエンコードするIca1遺伝子の発現を定量化する。これらをハウスキーピング遺伝子の発現量と比較した上で、組織間の差を検討する。
これらの結果を各遺伝子型で比較し、胸腺においてICA69の発現を抑制すると、ICA69を発現する複数の組織において自己免疫反応が惹起されることを明らかにしたい。以上により、ICA69に対する自己免疫の破綻が1型糖尿病の発症促進を惹起するか、また他の自己免疫性内分泌疾患を誘発するか否かを明らかにし、得られた知見をまとめる。

Causes of Carryover

平成30年度以降のICA-NODマウスの繁殖はほぼ順調であったが、とくにヘテロ欠損型の雌は①高血糖になりやすい、②交配に必要、③交配用としても高血糖を呈した場合は新しい雌マウスが必要、といった理由から不足しがちであった。途中で妊娠しにくいマウスもいたことから、予測したよりも出生数が少なく、実験で目標とする数に至らなかった。そのため飼育費や検体処理、実験に要する費用が少なかった。
最終年度は、昨年度に引き続き、マウスの飼育・繁殖のために動物施設の利用を継続するにあたり、飼育費が必要である。また血糖測定、DNAならびにRNA抽出、PCR、組織染色などに使用する試薬の不足分を購入する予定である。