Identifying the role of ICA69 in the induction of type 1 diabetes

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10084
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 田嶼 朝子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (00328337)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 1型糖尿病 / 自己免疫 / ICA69 / ノックアウトマウス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、1型糖尿病（T1D）の自己抗原のひとつであるICA69と、T1Dならびにそれに併発する他の自己免疫疾患の発症との関連を検討することを目的とする。研究対象として、遺伝子組換えにより作製したICA69ノックアウトNOD（ICA-NOD）マウスを用いた。
平成29年度：研究を実行するにあたり米国ピッツバーグ市、Institute of Cellular TherapeuticsからICA-NODマウスを輸入し、その繁殖を開始する予定とした。しかし同研究室におけるICA-NODマウスの繁殖が滞っており、輸入手続きにも時間を要したこと等から、実際にマウスの飼育や繁殖を開始できたのは平成30年2月であった。繁殖用の雌マウス2匹は輸入した時点で共に高血糖を呈し、その後死亡したため、ICA-NOD系統を継続させるための交配方法を新たに検討した。
平成30年度：米国から輸入したヘテロ欠損型の雄マウスとT1D自然発症モデルマウスであるNOD/ShiJcl（雌）との交配を開始し、年度内に69匹のICA-NODマウスが誕生した。遺伝子解析により、生まれたマウスを野生型、ヘテロ欠損型、ホモ欠損型に判別し、定期的な血糖測定により糖尿病発症時期を追跡した。また組織学的評価やRNA抽出のために胸腺、唾液腺、膵臓、甲状腺を採取した。
平成31年／令和元年度：これまでの実験を継続した。へテロ欠損型の雌は妊娠しても高血糖になると生まれた子マウスが脆弱であったり雌が育てられないため、生存するマウスが一時的に停滞した。その結果サンプル数が不足し、実験の継続を要した。
令和2年度：マウスの繁殖を継続すると同時に、目的とする週齢（12、20、30週）の糖尿病未発症マウスから胸腺、膵臓、甲状腺、唾液腺を採取した。野生型およびヘテロ欠損型における膵臓、甲状腺についてHE染色を行い、リンパ球浸潤の程度を評価した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度は実験対象となるICA-NODマウスの米国からの輸入が大幅に遅れ、実験開始の準備に主な時間を費やしたが、翌年度以降は繁殖を継続し、必要なサンプルを採取しながら実験を進めた。今年度はコロナウイルス感染対策として研究施設入室頻度を極力減らすため、繁殖のペースをやや抑えた時期があったが、ヘテロ欠損型同士の交配でICA-NOD系統を維持することができ、これまでに206匹のマウスが出生した。組織評価のために野生型、ヘテロ欠損型を主に使用したが、ヘテロ欠損型は繁殖にも使用するため、マウスが不足しがちであった。
遺伝子解析を行った201匹の遺伝子型の内訳は野生型：雄36匹、雌20匹、ヘテロ欠損型：雄60匹、雌58匹、ホモ欠損型：雄6匹、雌27匹と、雌のホモ欠損型の出生率は想定されるよりも低かった。長期観察の対象としたマウスは2～3週間毎に簡易血糖測定を行い、野生型24匹（雄18匹、雌6匹）、ヘテロ欠損型55匹（雄25匹、雌30匹）について糖尿病発症時期および発症率を評価した。その結果、ヘテロ欠損型の雌では野生型の雌雄と比べて約4週間早く発症し、ヘテロ欠損型の雄は野生型よりも2週間ほど遅く発症した。野生型の発症時期に雌雄差は見られなかった。32週齢における糖尿病発症率はヘテロ欠損型の雌で74％と最も高く、次いで野生型雌50％、野生型雄34％、ヘテロ欠損型雄12％であった。雌NODマウスの糖尿病発症率は通常70-80％とされるが、今回野生型雌での発症率がより低かった要因の一つとして、マウスの数が少なかったことが考えられる。
本年度は主に12、20、30週齢マウスからの膵臓、甲状腺の採取およびHE染色に取り組んだ。しかし繁殖の維持や糖尿病発症のため、とくにヘテロ欠損型からの検体を適切な時期に採取することが困難であり、検体数の確保が遅れている。また検体処理や組織学的評価に時間がかかっている。

Strategy for Future Research Activity

次年度は膵臓、甲状腺、胸腺、唾液腺のHE染色および免疫組織染色とその評価を中心として実験を進める。HE染色では組織中のリンパ球浸潤の程度をinsulitis scoreなどを用いて評価する。また各組織を抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗インスリン抗体、抗ICA69抗体で免疫組織学的に評価し、リンパ球の存在、インスリン、ICA69の発現程度をマウスの週齢や遺伝子型において比較する。量的評価として、各組織から抽出したRNAを用いてリアルタイムPCRによりIca1遺伝子の発現を定量化する。同時にICA-NODマウスの繁殖も継続し、不足するサンプル分のマウス（12、20、30週齢）から検体を採取して同様に評価する。

Causes of Carryover

コロナウイルス感染対策に伴う規制によってマウスの繁殖を一定期間控えたことや実験が滞ったため、予定していたよりも研究費の使用が少なかった。次年度もこれまで同様、マウスの繁殖を継続するために実験動物施設での飼育費を必要とする。その他は主に免疫組織染色やリアルタイムPCRなどに使用する試薬や、実験に必要な消耗品を購入する予定である。