2017 Fiscal Year Research-status Report
mRNA前駆体制御機構を基盤とした脊髄性筋萎縮症の病態解明
| Project/Area Number |
17K10089
|
|---|
| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
|---|
Principal Investigator |
荒川 正行 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 上級研究員 (90398868)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 脊髄性筋萎縮症 / SMN蛋白質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
脊髄性筋萎縮症(SMA)の病態解析で重要なことは、遺伝子検査によるSMN1遺伝子の欠失・変異の同定とSMN2遺伝子のコピー数の検出である。本研究では、SMN2遺伝子翻訳産物のSMN蛋白質の発現量に着目して、SMAI型患者由来皮膚線維芽細胞２株を用いて、SMN蛋白質の発現量を比較したところ、免疫染色法及びウエスタンブロット法によりSMN蛋白質の発現量が異なっていた。詳細な遺伝子検査（MLPA法）によりSMN2遺伝子のコピー数も２、３と異なっており、蛋白質量も高コピー数の方が高い発現傾向があった。さらに、リアルタイムPCR法にて、mRNA前駆体制御機能による全長SMN2mRNAとexon7のエキソンスキップしたトランケートなmRNA量もコピー数との相関を示した。これらの結果からSMN蛋白質の発現量による病態への影響を調べるために、コントロール（SMN1/SMN2遺伝子を有する）として正常ヒト皮膚線維芽細胞と２つの患者由来細胞のトータルRNAを用いた網羅的なRNA-seq解析を行った。その結果、以前行ったリアルタイムPCR法やRT-PCR法に準じたSMN2mRNAの定量評価を得ることができ、ウエスタンブロットの蛋白質量を裏付ける結果を得た。さらに、解析を続けた結果、正常皮膚線維芽細胞と比べて、SMAI型由来線維芽細胞では、細胞骨格系の遺伝子群やその制御遺伝子群が高発現していることが明らかとなった。特に、アクチン制御遺伝子５つに着目して、現在、蛍光免疫染色法、ウエスタンブロット法や免疫沈殿法を用いて、それぞれの蛋白質の発現量とその細胞内局在を詳細に調べている。また、これらの遺伝子群が神経幹細胞から運動神経細胞に分化する時の表現系の影響を調べるために、ヒト脊髄由来神経幹細胞の培養条件の検討を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、患者由来細胞のSMN蛋白質の発現量の違いによる表現系を調べるために、網羅的な遺伝子発現解析法としてRNA-seq解析を行った。その結果、網羅的な解析に予想以上に時間がかかった。現在、その解析によって抽出された遺伝子の細胞における機能解析を一つずつ細胞系による確認実験を行っているために進捗はやや遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後も網羅的な遺伝子発現解析から抽出された遺伝子群の細胞における機能解析を進めて、培養細胞系による表現系を明らかにして、これらの結果を基にヒト脊髄由来神経幹細胞の培養系を確立するとともに、表現系を調べる予定である。
|
| Causes of Carryover |
脊髄性筋萎縮症患者由来細胞の網羅的な遺伝子解析により抽出された遺伝子群の解析が遅れているために、神経幹細胞の培養系の構築が遅れたために生じた。その培養系の構築のために次年度に使用する。
|
| Remarks |
公益財団法人微生物化学研究会 微生物化学研究所ホームページ http://www.bikaken.or.jp
|
