2017 Fiscal Year Research-status Report
次世代シーケンサーを応用した小児重症ウイルス感染症の診断
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17K10107
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
川田 潤一 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (20532831)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 嘉規 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (20373491)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 次世代シーケンサー / ウイルス / 劇症肝炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
既知のウイルス感染症患者より採取された血清からDNAおよびRNAの抽出し、DNA、RNAライブラリーを作成した。DNAライブラリーはNextera XT (illumina)を使用した。RNAライブラリーはOvation RNA-Seq (NuGen)、ScriptSeq (illumina)、SMARTer Strand RNA-Seq (Takara Bio)の3つのキットで、C型肝炎ウイルスを含んだ血清を用いて、ウイルスRNAの検出感度の比較を行った。比較検討した3つのキットの中では、Ovation RNA-Seq System が、最も高感度でウイルス由来のRNAを検出できたため、以後の解析は、このキットを用いた。DNAウイルスについては。Nextera XTでウイルス由来核酸が高感度で検出されることを確認した。
平成29年度は、劇症肝炎の臨床検体を解析した。小児の劇症肝炎20症例の血清からDNAおよびRNAライブラリーを作成し、次世代シーケンサー(HiSeq 2500) により1検体あたり約1500万リードの判読を行った。得られた結果をメタゲノム情報解析パイプライン（MePIC）により解析し、国際データベースに登録されている既知の全てのウイルスの配列の有無を検討した。パイプラインでウイルス由来のリードの存在が示唆された検体に関してはCLC workbench (CLC bio)を用いて、各ウイルス配列へのマッピングや配列相同性を確認した。20症例中、7症例において何らかのウイルス由来の配列の存在が示唆された。非特異的な配列等と考えられるものを除くと、3例で有意なウイルス由来配列の存在が確認された（TTウイルス2例、アデノ随伴ウイルス1例）。しかしならが、これらのウイルスの病原性については未知の部分が多く、劇症肝炎との関連については、さらなる検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 次世代シーケンサーによる臨床検体からのウイルス検出系の構築
既知のウイルス感染症患者より採取された血清からDNAおよびRNAの抽出し、DNA、RNAライブラリーを作成した。DNAライブラリーはNextera XT (illumina)を、RNAライブラリーはOvation RNA-Seq (NuGen)を用いることで、ウイルス由来核酸が高感度で検出されることが可能であった。血清検体は、DNAやRNAがごく少量しか含まれていないため、ライブラリーを作成するために十分な量が得られていないことが危惧された。特にRNAライブラリーの作成においては、抽出されたRNAが必要量に満たないため、解析に必要なライブラリーを作成が困難であり、ウイルスRNAの検出高率も不十分であった。しかしながら、Ovation RNA-Seqは、ごく少量のRNAからも解析に必要なRNAライブラリーを作成することが可能であり、1000万リード程度の解析を行うことで、一般に用いられる定量PCRとほぼ同程度の感度で検出することが可能であった。さらに、ウイルス配列の詳細についもて解析することが可能であり、次世代シーケンサーによる臨床検体からのウイルス検出は、非常に有用な手法であることが示唆された。
（2）病原ウイルス不明の劇症肝炎からのウイルス検出
平成29年度は、小児の劇症肝炎20症例の解析を行い、3例で有意なウイルス由来配列の存在が確認された（TTウイルス2例、アデノ随伴ウイルス1例）。これらの症例は、各種検査を行ったにもかかわらず原因は特定できなかった症例であり、次世代シーケンサーによるウイルス核酸の検出が、診断に有用である可能性が示唆された。しかしならが、今回の解析で特定されたウイルスの病原性については未知の部分が多く、疾患との関連については、さらなる検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）病原ウイルス不明の臨床検体からのウイルス検出
前年度に引き続き、次世代シーケンサーによるウイルス検出を行う。平成30年度は、急性心筋炎および、免疫不全宿主における重症感染症患者の臨床検体を解析する予定であり、各疾患群とも20症例程度を予定している。また、血清検体に加えて、生検組織や肺胞洗浄液の検体など用いた解析も検討しており、これらの臨床検体を用いることで、より疾患と関連した病原ウイルスの検出が期待される。
さらに、メタゲノム解析で既知の病原ウイルスが検出されなかった症例を中心に、 de novo アセンブリ解析をCLC workbenchや、Virus TAP (国立感染症研究所)用いて行う。 de novo アセンブリ解析は、断片化された核酸の塩基配列を再構築する手法である。再構築された配列と、既知のウイルスとの相同性と検証することで、何らかのウイルスの存在が疑われた場合には、より多量の解析を行うことで、新規ウイルスの全塩基配列の解読を試みる。
（2）ウイルスの病原性の検証
病原ウイルスが検出された検体に関しては、次世代シーケンサーの判読リード数を増やして再解析を行うことで、ウイルスの分子疫学や病原性に関連した遺伝子の解析等を行う。また、肝生検などで患者の病変組織が得られている場合には、組織を用いて次世代シーケンサーによる解析を行うとともに、ウイルスの免疫染色やPCR法を行うことで、組織への感染の有無を評価し、さらに病理学的な検証を行う。さらには、末梢血や組織の検体を用いて、ウイルス感染時に誘導される免疫応答についても評価する予定である。これらの解析を通じて、ウイルスと臨床病態との関連についての検証を試みる。
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| Causes of Carryover |
次世代シーケンサーによる病原ウイルスの解析のために、MiSeq Reagent Nano Kit2 を購入する必要があったが、29年度の経費が不足しており、次年度に購入し解析をすすめる予定である。
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[Journal Article] Survey of rotavirus-associated severe complications in Aichi Prefecture2018
Author(s)
Hattori, F. Kawamura, Y. Kawada, J. I. Kojima, S. Natsume, J. Ito, K. Saito, S. Kitagawa, Y. Okumura, A. Yoshikawa, T.
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Journal Title
Pediatr Int
Volume: 60
Pages: 259-263
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Comprehensive detection of pathogens in immunocompromised children with bloodstream infections by next-generation sequencing2018
Author(s)
Horiba, K. Kawada, J. Okuno, Y. Tetsuka, N. Suzuki, T. Ando, S. Kamiya, Y. Torii, Y. Yagi, T. Takahashi, Y. Ito, Y.
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 8
Pages: 3784
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Treatment with silver nitrate versus topical steroid treatment for umbilical granuloma: A non-inferiority randomized control trial2018
Author(s)
Ogawa, C. Sato, Y. Suzuki, C. Mano, A. Tashiro, A. Niwa, T. Hamazaki, S. Tanahashi, Y. Suzumura, M. Hayano, S. Hayakawa, M. Tsuji, T. Hoshino, S. Sugiyama, Y. Kidokoro, H. Kawada, J. Muramatsu, H. Hirakawa, A. Ando, M. Natsume, J. Kojima, S.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 13
Pages: e0192688
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Comprehensive detection of viruses in pediatric patients with acute liver failure using next-generation sequencing2017
Author(s)
Suzuki, T. Kawada, J. Okuno, Y. Hayano, S. Horiba, K. Torii, Y. Takahashi, Y. Umetsu, S. Sogo, T. Inui, A. Ito, Y.
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Journal Title
J Clin Virol
Volume: 69
Pages: 67-72
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Metabolome analysis reveals the association between the kynurenine pathway and human herpesvirus 6 encephalopathy in immunocompetent children2017
Author(s)
Torii, Y. Kawano, Y. Sato, H. Fujimori, T. Sasaki, K. Kawada, J. Takikawa, O. Lim, C. K. Guillemin, G. J. Ohashi, Y. Ito, Y.
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Journal Title
Metabolomics
Volume: 13
Pages: 126
DOI
Peer Reviewed
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