ダウン症造血異常の責任遺伝子同定を目指した疾患iPS細胞ライブラリーの樹立

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10108
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 荒堀 仁美 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40379186)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 講師 (80506494)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群では21番染色体上にコードされる遺伝子の量効果（gene dosage effects）によってさまざまな合併症が引き起こされる。しかし病態責任遺伝子がどこにあるのかは分からない。そこで本研究においては、ゲノム編集技術をもちいて、ヒトXIST遺伝子をテトラサイクリン誘導システム下に制御することのできる21トリソミー部分不活化iPS細胞ライブラリーの樹立を目指す。
今年度はまずヒトiPS細胞に導入するためのXISTベクターの作成を行った。XISTは可逆的な発現誘導をかけるため、Tetシステムをもちいることとした。
まずTetトランスアクチベーター配列として、Tet-On 3Gコンストラクトを作成した。これはEF1aプロモーター下にTet-ON 2Gを、PGKプロモーター下にNeoをつなげたダブルプロモーター配列としたものである。つぎにTet応答因子配列として、まずEF1aプロモーター下にPuroΔTK配列がつながったものをloxP/lox5171に挟んだ挿入カセットを作成した。これは最初に21番染色体上に挿入するための挿入カセットとなる。つぎにTRE3Gプロモーター下にhuman XISTをつないだものを、やはりloxP/lox5171にはさまれたコンストラクトを作成した。
ヒトXIST cDNAについては７つのフラグメントになったものを入手し、それらをつなぎあわせることで作成した。完全長のXISTを作成するのは容易でなく、その完成に難渋したが、Gibson Assembly法をもちいることで完成することができた。
最終的には塩基配列を読み、これらの配列が正常であることを確認した。このようにしてすべてのコンストラクトを作成することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

XISTの配列は17kbと大きいため、フラグメントをつなぎ合わせることは容易ではなかったが、gibson assemblyをもちいることで乗り越えることができた。
年度内に目的のコンストラクト作成を完成させることができた。

Strategy for Future Research Activity

次年度はiPS細胞への導入を行う。
まずTetトランスアクチベーター配列をヒトsafe harbor領域である19番染色体AASV1領域へ導入する。つぎにTet応答配列を21番染色体上に誘導する。

Causes of Carryover

ゲノム編集をもちいたヒトiPS細胞への遺伝子導入に多くの費用がかかるはずであったが、今年度はコンストラクトの完成のみにとどまった。来年度に使用する予定である。