ダウン症造血異常の責任遺伝子同定を目指した疾患iPS細胞ライブラリーの樹立

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10108
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 荒堀 仁美 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40379186)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 講師 (80506494)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集 / 染色体異常

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群では21番染色体上にコードされる遺伝子の量効果（gene dosage effects）によってさまざまな合併症が引き起こされる。しかし病態責任遺伝子がどこにあるのかは分からない。そこで本研究においては、ゲノム編集技術をもちいて、ヒトXIST遺伝子をテトラサイクリン誘導システム下に制御することのできる21トリソミー部分不活化iPS細胞ライブラリーの樹立を目指す。この方法は以下の通りとなる。
【Tet トランスアクチベーター】Tet-On 3G コンストラクトの作成　　【Tet 応答因子配列】1．loxP/lox5171 挿入カセットの作成（CRISPR/Cas9）　2．XIST cDNA のクローニング、PTRE3G-XIST コンストラクトの作成　3．PTRE3G- XIST 配列の挿入
昨年度までにヒトiPS細胞に導入するためのXISTベクターの作成と、Tet制御システムをもちいたすべてのコンストラクトを作製することができた。本年度はこれらのiPS細胞への挿入を行った。まずCRISPR/Cas9 による相同組換えを利用し、Tet-On 3G コンストラクトを19 番染色体AAVS1 領域へと挿入した。つぎに21 トリソミーiPS 細胞の21 番染色体上へloxP/lox5171 挿入カセットを導入した。さらにloxP/lox5171 を利用して挿入カセットとの交換によりPTRE3G-XIST コンストラクトの挿入を行った。
これによりすべてのiPS細胞を樹立することができた。さらに核型解析を行い、これらの核型に異常が生じていないことも確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

想定通り、ゲノム編集技術をもちいてコンストラクトをiPS細胞へと挿入することができた。

Strategy for Future Research Activity

作製したiPS細胞に対してDox投与を行い、XISTによる遺伝子サイレンシングが起こるか確認する。

Causes of Carryover

予定していた実験計画に必要な試料の調達に時間がかかり、正確な解析を行うためには十分な準備のうえ次年度に行うことが必要と思われたため。