Generation of disease-specific iPSC library for the identification of responsible genes in Down syndrome

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K10108
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 荒堀 仁美 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40379186)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北畠 康司 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80506494)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ダウン症候群 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群では21番染色体上にコードされる遺伝子の量効果（gene dosage effects）によってさまざまな合併症が引き起こされる。しかし病態責任遺伝子がどこにあるのかは分からない。そこで本研究においては、ゲノム編集技術をもちいて、ヒトXIST遺伝子をテトラサイクリン誘導システム下に制御することのできる21トリソミー部分不活化iPS細胞ライブラリーの樹立を目指す。この方法は以下の通りとなる。
昨年度までにヒトiPS細胞に導入するためのXISTベクターの作成と、Tet制御システムをもちいたすべてのコンストラクトを作製し、さらにCRISPR/Cas9 による相同組換えを利用し、それらをiPS細胞へと導入した。そしてこのiPS細胞をもちいて、XISTの発現が起きているかどうか、実際に遺伝子発現の抑制が起きたかどうかについて、RNA-FISH・H3K27me3の免疫染色・ChIP-seqを行い、Doxycycline依存性にXISTによる遺伝子発現抑制が起きていることを確認することができた。
今年度はこのXIST-iPS細胞を造血細胞系へと分化誘導を行ったが、XISTの発現を確認するための安定した分化細胞を得ることができなかったため、先にアストロサイトへの分化誘導を行った。アストロサイトメディウムをもちいることでほぼ100％の細胞がvimentin陽性のアストロサイト前駆細胞（APC）へと分化させることが可能となった。そしてダウン症ではこのAPCの増殖速度が異常に更新していることも見つけた。この細胞系列ををもちいてDoxycyclineを投与ののちに除去したところ、XISTによる遺伝子発現不活化はほとんどの遺伝子で保持されているにも関わらず、一部の遺伝子で発現が回復している、APCの異常増殖も同様に回復していることが分かった。この表現型と遺伝子発現系を丁寧に解析することで、DS-APCの異常増殖をもたらす遺伝子としてDYRK1AとPIGPを同定することに成功した。