2017 Fiscal Year Research-status Report
インフルエンザ新規治療戦略及びウイルス感染細胞アポトーシス制御に関する基礎的検討
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17K10119
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
佐藤 晶論 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (60423795)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
橋本 浩一 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (50322342)
細矢 光亮 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (80192318)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / プロテアーゼ阻害薬 / ノイラミニゼー阻害薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.まず、基礎実験としてインフルエンザウイルス感染実験で汎用されているMDCK細胞を用い、H1亜型インフルエンザウイルスの野生株（以下WT）とオセルタミビルとペラミビルに感受性が低下したH275Y変異株（以下H275Y変異株）を感染させ、段階希釈したNA阻害薬（NAI）（オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル）とプロテアーゼ阻害薬（PI）とともに72時間培養し、各薬剤単独およびPIとNAIとの併用効果について、培養上清中のウイルス量を定量し、コントロールに比較してウイルス量を半減できる薬剤濃度（EC50）を検討した。
（1）WTに対するオセルタミビル、ザナミビルおよびペラミビルのEC50は、それぞれ、46.0 nM、49.6 nMおよび5.5 nM、PIであるCamostat Mesilate（以下CM）とNafamostat Mesilate（以下NM）のEC50はそれぞれ4.3 μMと0.9 μMであった。
（2）H275Y変異株に対するオセルタミビル、ザナミビルおよびペラミビルのEC50は、それぞれ、> 10,000 nM、81.4 nMおよび2,940 nM、CM とNMのEC50はそれぞれ3.8 μMと1.4 μMであった。
（3）WTとH275Y変異株について、各NAIと各PIを併用したところ高い相乗効果を認めた。特に、ヒトにおいて静注製剤であるペラミビルとNMとの併用で最も高い相乗効果が認められた。なお、各NAIと各PIについて、それぞれ最高濃度である10,000 nMと1,000 μMで細胞毒性を示さなかった。
2.次年度以降の研究のため、ヒト線維芽細胞にH1亜型WTとH275Y変異株を感染させ、ウイルスヘマグルチニン非開裂のウイルスを回収した。このウイルスはヒト気道での感染性獲得機序の解明とPIによる抗ウイルス効果を確認するために使用予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（HA）が非開裂状態のウイルスを回収するため、ヒト線維芽細胞にウイルスを感染させ増やす必要があるが、手持ちのウイルスはヒト線維芽細胞で増えにくいことが確認された。そのため、ウイルスをヒト線維芽細胞に馴化させるために、一旦ヒト線維芽細胞から回収したウイルスを繰り返しヒト線維芽細胞に感染させ回収させる工程を何度も繰り返す必要があった。
さらに、ヒト気道上皮細胞に発現しHA開裂に寄与しているTMPRSS2という膜貫通型のセリンプロテアーゼをMDCK細胞に導入しようとするも、導入困難であることが判明したため、不死化したヒト気管上皮細胞を購入し、これによりin vitroでウイルスがヒト気管上皮細胞に感染・複製する様子を再現することに計画を変更した。しかし、この細胞を入手するための手続きに時間を要し、さらに、この細胞を培養するための培養液は米国から輸入する必要があったが、米国での関税の手続きに思いのほかの時間を要したため、この細胞を入手するために約3か月の時間を要した。この細胞が実際にインフルエンザウイルスの感染・増殖に適しているかどうかを確認する作業にも時間を要したため、ヒト気管支上皮細胞を用いてウイルス感染させ、NAIとPIとの併用による抗ウイルス効果について検討するに至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画当初はMDCK細胞にヒト気管上皮細胞に発現しているTMPRSS2を発現させ、ウイルスヘマグルチニン（HA）非開裂のウイルスが開裂する機序を解明する予定であったが、TMPRSS2の導入が困難であるため、不死化ヒト気管支上皮細胞を用いてヒトでのウイルス複製の様子をin vitroで再現する。
ヒト気管支上皮細胞を用いることで、インフルエンザウイルスのヒト呼吸器への感染様式や感染細胞のアポトーシス、サイトカイン産生様式などをin vitroである程度再現できことを確認する。
つまり、今後は、HA非開裂のウイルスとヒト気管支上皮細胞を用いて、HA開裂の時間的・空間的機序を解析し、さらに、ヒト気管支上皮細胞に感染したウイルスが細胞のアポトーシスを誘導するかどうか、さらにその際にHtrA2というセリンプロテーゼを介したアポトーシス経路も誘導されるのかどうかを検討する。もし、HtrtA2が誘導される場合、HtrA2がHAの開裂に関与するかどうか、つまり、ウイルスの感染性獲得にHtrA2が寄与するかどうかを検討する。
HtrA2はセリンプロテーゼであるため、PIでその効果を阻害できるかどうかを検討し、PIが直接的な抗ウイルス効果のみならず、感染細胞の細胞死を抑制でき、気管支細胞の損傷を抑制できるかどうかを検討する。
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| Causes of Carryover |
ヒト気管支上皮細胞購入自体の手続きに時間を要したこと、さらにヒト気管支上皮細胞用の培養液は米国本土から輸入する必要があったが、税関上の事務手続きに約3か月間の時間を要した。これらのことが、ヒト気管支上皮細胞を用いたウイルス感染実験遂行を遅らせる原因となった。さらに、ヒト線維芽細胞を用いたHA非開裂のインフルエンザウイルスを作製するために、ウイルスを細胞に馴化させるために時間を要した。そのため、当初予定した研究計画が遅延することとなり、必然的に購入予定であったディスポーザブル用品の購入も少なくなったことが、次年度使用額が生じた主な要因である。
次年度に向けての研究材料はほぼそろっているため、今年度未達成の実験と次年度に予定されている実験を進めることができるため、必要な研究資材を購入する予定である。
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Research Products
(3 results)
