2017 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of virus-associated encephalopathies by dynamics evaluation of tight-junction using human cerebral vascular endothelial cells
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17K10120
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
細矢 光亮 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (80192318)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 幸彦 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (00305369)
橋本 浩一 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (50322342)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ウイルス性脳症 / 脳血管内皮細胞 / 血管透過性 / サイトカイン / TNF-α / タイト結合 / 経内皮電気抵抗 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、脳血管内皮細胞による検討が必要であり、より再現性のある実験が可能なヒト脳血管内皮細胞不死化細胞株（HCMEC/D3）を用いた。細胞は、CELLutions Biosystems Inc.のCLU512を購入し、培地は、PromoCellのEndothelial Cell Growth Medium MV2 kitを用いて、安定して培養できることを確認した。1型コラーゲンをコーティングしたトランスウェル膜上にHCMEC/D3を単層培養し、コンフルエントに達した後にCellZscope(CellSeed社)を用いて経内皮電気抵抗値（TER）を測定した。TERが上昇し、プラトーになった段階で、培養液中に炎症性サイトカインであるTNF-αを濃度100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mLで添加した。TNF-α濃度依存的にTERが減少するのを確認し、in vitro血管内皮細胞障害モデルを作成した。さらにTER測定に使用した同じトランスウェルシステムを用いて、FITC標識デキストランによる溶質透過性試験を行った。分子量10kDa、70kDaのFITC標識デキストランを使用したが、TNF-α添加による血管透過性の亢進は認めなかった。また、タイト結合を構成するClaudin-5,Occludin,ZO-1について免疫染色を行い、タイト結合の局在変化を検討した。TNF-α添加によるタイト結合の蛋白発現や局在変化は認めなかった。HCMEC/D3にTNF-αを添加すると、イオンレベルの透過性の変化は認めたが、分子量が10kDa以上のトレーサーの透過性には変化を来さず、タイト結合蛋白の局在変化は認めなかった。脳血管内皮細胞では、TNF-αは、タイト結合におけるイオンレベルの透過性に影響を及ぼす可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
最初にヒト脳血管内皮細胞不死化細胞株（HCMEC/D3）は、Merck MilliporeのSC066を購入し検討した。しかし、安定したTERの上昇が得られず、in vitro血管内皮障害モデルを作成することができなかった。次にCELLutions Biosystems Inc.のCLU512を購入し検討した。安定したTERを得るための条件を検討し、TER上昇を確認後に、炎症性サイトカインであるTNF-αを添加し濃度依存的にTERの減少を確認することができた。しかし、再現性のある安定したTER上昇を得るトランスウェルシステムの条件設定に苦慮している状態である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、安定したin vitro血管内皮障害モデルを構築し、薬剤として、ステロイド剤などの免疫抑制剤、抗サイトカイン抗体、またはタイト結合の形成を促進させ血管透過性を改善させうる薬剤（cyclic AMP、フォスフォジエステラーゼ阻害剤、エストロゲン）、予後悪化因子である解熱消炎鎮痛剤（シクロオキシゲナーゼ阻害剤）などについて血管内皮細胞障害モデルに対する影響を検討する。
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| Causes of Carryover |
消耗品は計画的に購入し研究を進めてきたが、974円が未執行となってしまった。少額であるので、次年度の消耗品購入に充てて計画的に研究を進める。
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