A New therapeutic strategies for acute encephalitis by targeting astrocytes

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10121
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤田 政隆 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (10360637) ; 加藤 晋 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (90551250)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: アクアポリン / 血液脳関門 / アストロサイト / 蛍光タンパク / 急性脳症

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き、アストロサイトの活性化状態を検出する指標として、アクアポリン4(以下AQP4)を利用し研究を進めた。AQP4の細胞内局在をリアルタイムで観察するために、 蛍光タンパクとの融合タンパクを遺伝子導入により発現させ観察することとした。昨年度構築した、ヒトAQP4cDNAの細胞外ループに相当する部分に、pH感受性で緑色を呈する pHluorinの遺伝子を挿入し、AQP4cDNAのC末端側に赤色を呈するmKateを挿入した発現ベクターを用い、また、比較対象として、AQP4cDNAのC末端側 にmKateのみを挿入した発現ベクターも利用した。さらにAQP4のアイソフォームによる局在の変化の可能性も考慮し、AQP4-M1(1番目のメチオニンからのアイソ フォーム)とAQP4-M23(23番目のメチオニンからのアイソフォーム)の合計4種類のベクターを準備した。 これら発現ベクターを、ラットアストロサイトーマ細胞C6及び本研究室で樹立したラットアストロサイト不死化細胞ACT57に遺伝子導入し、導入後から24時間ごとに96時間後まで、蛍光タンパクの発現と局在を観察した。 pHluorinとmKateの両者を含む発現ベクターを遺伝子導入した場合、両者の蛍光が観察され、mKateのみの場合は、赤色のみ検出された。 ACT57細胞においても、pHluorinのpH感受性と原形質膜上の発現を確認するため、培養液ののpHを7.4からpH6.0に変化させたところ、pHluorinの蛍光が消退した。これによりpHluorinの pH感受性と、原形質膜上にあるタンパクが緑色蛍光を発している可能性が示唆された。但し、ACT57細胞においても、遺伝子導入効率が悪く、改善の余地があり、大きな課題となった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

平成30年度中にアストロサイトでのAQP4タンパクの発現系を樹立し、血管内皮細胞との共培養系を開始する予定であったが、アストロサイトにおけるAQP4タンパ クの発現系の樹立に時間がかかり、血管内皮細胞との共培養系の実験を開始することが出来なかった。

Strategy for Future Research Activity

AQP4の発現系は、現在のところ発現ベクターを用いているが、遺伝子導入効率がやや悪く、大きな課題となった。今後は、安定発現株の樹立やウイルスベクターによる 発現系も考慮する。

Causes of Carryover

初代培養アストロサイトを用いた研究を企画していたが、研究に遅れが生じたため、予定していた試薬・培養液の購入を見合わせた。次年度に細胞培養液、血清等の購入を予定している。