2020 Fiscal Year Annual Research Report
A New therapeutic strategies for acute encephalitis by targeting astrocytes
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17K10121
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
浅井 清文 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (70212462)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 政隆 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (10360637)
加藤 晋 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (90551250)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アクアポリン / 血液脳関門 / アストロサイト / 蛍光タンパク / 急性脳症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究を継続し、AQP4の細胞内局在をリアルタイムで観察するために、蛍光タンパクとの融合タンパク質を培養細胞に遺伝子導入し発現させた。AQP4のアイソフォームにより分子 の集合状態が変化することが分かっているので、AQP4-M1(1番目のメチオニンからのアイソフォーム)とAQP4-M23(23番目のメチオニンからのアイソフォーム) をベースとしたベクターを構築した。細胞質内または細胞内小胞に存在するAQP4と細胞膜上に局在するAQP4を見分けることが出来ないかと考え、M1とM23のヒト AQP4cDNAの細胞外ループに相当する部分にpH感受性で緑色を呈するpHluorinの遺伝子を挿入し、AQP4cDNAのC末端側に赤色を呈するmKate遺伝子を挿入した発現ベ クターを構築した。また、比較対照として、M1とM23のAQP4cDNAのC末端側にmKateのみを挿入した発現ベクターも準備した。これらのベクターを本研究室で樹立 したラットアストロサイト不死化細胞ACT-57に遺伝子導入し、導入後から96時間後までの蛍光タンパクの発現と局在を観察した。pHluorinとmKateの両者の発現 を確認するとともに、pHluorinの蛍光にpH感受性があることも確認出来たことから、構築したベクターが予定通りの融合タンパクを発現していることが確認出来た。一昨年、この発現系を用いて、血管内皮細胞との共培養系の研究を開始したが、当初予定していた重層培養系では、共培養による明確な局在変化が見られなかったため、コラーゲンゲルを用いた三次元培養系による局在変化についても検討を加えたが、計画年度内に明確な結果を得ることが出来なかった。
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