フォン・ウィルブランド因子D'D3ドメイン一塩基多型の分子生物学的解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10128
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 荻原 建一 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50623500)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: フォン・ウィルブランド因子 / 一塩基多型 / 凝固第VIII因子

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではフォン・ウィルブランド因子（VWF）が凝固第VIII因子（FVIII）と結合する上で重要なD'D3ドメインの機能増強を起こし得る遺伝子バリアントをin silico解析により探索し、機能増強型VWF遺伝子の存在を探る目的のもと、初年度は以下の３ステップの計画のうちステップ②の展開にとどまった。
①HEK293T細胞を用いたヒトVWF蛋白の発現モデルの確立：ヒトVWFcDNAを挿入したプラスミドを作成し培養皿内でHEK293T細胞へのトランスフェクションを実施し、培養上清中のVWF蛋白の抗原量をELISAにて測定したところ、VWF蛋白の発現が予想外に低濃度であり、現在条件調整中である。コラーゲンをプレートに固相化しサンプルVWFを添加することによるコラーゲン結合能（VWF:CB）測定系、および抗VWF抗体をプレートに固相化しサンプルVWFを添加し、次いでFVIIIを添加し結合FVIII量を定量することによるFVIII結合能（VWF:FVIIIB）測定系は確立できており、VWF蛋白の発現効率を修正したのちにこれら機能解析は実施可能な状態にある。
②D'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込み：VWDデータベース（http://www.hemobase.com/vwf/VWF_Database/ISTH_Database/ISTH_Database.html）およびVWFバリアントデータベース(http://evs.gs.washington.edu/EVS/, Johnsen Blood 2016)から、VWFのD'D3領域（S764-P1247）のtype2N VWD変異29箇所とその周辺の一塩基多型72箇所を抽出した。これらの配列から予測される蛋白構造、RNA構造、スプライシング部位を各種in silico解析ツールを用いて探索し、機能増強可能性のある10-12のバリアント候補を絞り込んだ。
③絞り込んだ候補多型/変異のVWF蛋白の発現と解析：VWF蛋白発現のための条件調整中であり、VWFバリアント蛋白の発現には至っていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまで発現できていたVWF蛋白の発現量が低下し、プラスミド配列やトランスフェクション工程の見直しを行い、現在も条件調整中である。そのため③のバリアント蛋白発現のステップに進むことができなかった。しかし、②のin silico解析による機能増強候補バリアントの設計は進行しており、①のトラブルシューティングが解決しだい、速やかに発現実験と蛋白機能解析を行う準備は整えている。

Strategy for Future Research Activity

VWF発現のトラブルシューティングに全力をあげる。かつて留学していた海外の研究室にも条件調整解決のヒントを求める。また当教室で他の凝固因子蛋白の発現に成功している大学院生にも協力を得ながら、機能解析に十分なVWF蛋白量を確保する。同時併行で機能増強バリアント候補のcDNA作成を進め、 VWF蛋白発現系の修正・再開後に速やかにバリアント蛋白の発現ができるようにする。さらに次のステップであるVWFノックアウトマウスを用いた実験の手続きと準備を進めておく。