フォン・ウィルブランド因子D'D3ドメイン一塩基多型の分子生物学的解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10128
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 荻原 建一 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50623500)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: フォン・ウィルブランド因子 / 一塩基多型 / 第VIII因子

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではフォン・ウィルブランド因子（VWF）が凝固第VIII因子（FVIII）と結合する上で重要なD'D3ドメインの機能増強を起こし得る遺伝子バリアントをin silico解析により探索し、機能増強型VWF遺伝子の存在を探る目的のもと、以下の4ステップの計画のうち、ステップ③に進んでいる。
①HEK293T細胞を用いたヒトVWF蛋白の発現モデルの確立：ヒトVWFcDNAを挿入したプラスミドを作成し培養皿内でHEK293T細胞へのトランスフェクションを実施し、VWF蛋白を発現し、その機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を確認した。
②D'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込み：VWDデータベースおよびVWFバリアントデータベースから、VWFのD'D3領域（S764-P1247）のtype2N VWD変異とその周辺の一塩基多型を抽出し、これらの配列から予測される蛋白構造、RNA構造、スプライシング部位を各種in silico解析ツールを用いて探索し、機能増強可能性バリアント候補を絞り込んだ。
③絞り込んだ候補多型/変異のVWF蛋白の発現と解析：バリアントのうち、複数のVWFバリアント蛋白の発現を実施し、そのVWF機能（コラーゲン結合能、FVIII結合能）を解析した。FVIII結合能増強バリアントは同定されておらず、引き続き候補バリアント蛋白の機能解析を継続している。
④VWFノックアウトマウスを用いたヒトVWFcDNAのin vivo発現実験:VWF発現量、FVIII結合能の変化量が多かった多型/変異を絞り込み、VWFノックアウトマウスへの遺伝子導入を予定している。
ステップ④に進むに至っておらず、研究期間を1年延長した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度にVWF蛋白発現工程の条件調整が必要であったため、①のステップに遅れが生じ、③のバリアント蛋白発現のステップに進むことができなかった。その問題は解決したが、発現VWF蛋白の機能解析において機能増強を確認するに至っていない。

Strategy for Future Research Activity

バリアント蛋白の発現種類をさらに増やしてその機能増強可能性のあるバリアントを同定し、最終ステップであるVWFノックアウトマウスを用いた実験を実施する。

Causes of Carryover

消耗品の費用が予定より少額であったため。延長された次年度で当初計画で必要な物品へ使用予定である。