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2020 Fiscal Year Research-status Report

フォン・ウィルブランド因子D'D3ドメイン一塩基多型の分子生物学的解析

Research Project

Project/Area Number 17K10128
Research InstitutionNara Medical University

Principal Investigator

荻原 建一  奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50623500)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 野上 恵嗣  奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
Project Period (FY) 2017-04-01 – 2022-03-31
Keywordsフォン・ウィルブランド因子 / 一塩基多型 / 第VIII因子
Outline of Annual Research Achievements

本研究ではフォン・ウィルブランド因子(VWF)が凝固第VIII因子(FVIII)と結合する上で重要なD'D3ドメインの機能増強を起こし得る遺伝子バリアントをin silico解析により探索し、機能増強型VWF遺伝子の存在を探る目的のもと、以下の4ステップの計画のうち、ステップ③に進んでいる。
①HEK293T細胞を用いたヒトVWF蛋白の発現モデルの確立:ヒトVWFcDNAを挿入したプラスミドを作成し培養皿内でHEK293T細胞へのトランスフェクションを実施し、VWF蛋白を発現し、その機能(コラーゲン結合能、FVIII結合能)を確認した。
②D'D3ドメインの多型/変異候補の探索と絞り込み:VWDデータベースおよびVWFバリアントデータベースから、VWFのD'D3領域(S764-P1247)のtype2N VWD変異とその周辺の一塩基多型を抽出し、これらの配列から予測される蛋白構造、RNA構造、スプライシング部位を各種in silico解析ツールを用いて探索し、機能増強可能性バリアント候補を絞り込んだ。
③絞り込んだ候補多型/変異のVWF蛋白の発現と解析:バリアントのうち、複数のVWFバリアント蛋白の発現を実施し、そのVWF機能(コラーゲン結合能、FVIII結合能)を解析した。FVIII結合能増強バリアントは同定されておらず、ステップ②を再実施したうえで、機能解析を継続している。
④VWFノックアウトマウスを用いたヒトVWFcDNAのin vivo発現実験:VWF発現量、FVIII結合能の変化量が多かった多型/変異を絞り込み、VWFノックアウトマウスへの遺伝子導入を予定している。
ステップ④に進むに至っておらず、研究期間を延長している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度にVWF蛋白発現工程の条件調整が必要であったため、①のステップに遅れが生じ、③のバリアント蛋白発現のステップに進むことができなかった。2020年度には、ベクターのHEK細胞への導入にpiggyBacトランスポゾンを用いることで、変異VWFの安定的発現に成功した。しかし、機能解析において機能増強を確認するに至っていなかった。そのため、②のステップを再度見直し、機能増強変異の候補を再検討し、候補変異を増やして発現VWFバリアントのFVIII結合能試験を繰り返している。野生株とType2N変異株(T789P)の結合能は想定どおりであるが、野生株を上回る結合能を示す変異株の同定に至っていない。

Strategy for Future Research Activity

バリアント蛋白の発現種類を増やすだけでなく、純化精製過程の見直しも検討する。機能増強可能性のあるバリアントを同定し、最終ステップであるVWFノックアウトマウスを用いた実験につなげたい。

  • Research Products

    (3 results)

All 2020

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Evaluation of clinical severity in patients with type 2N von Willebrand disease using microchip-based flow-chamber system2020

    • Author(s)
      Nakajima Y, Nogami K, Yada K, Kawamura T, Ogiwara K, Furukawa S, Shimonishi N, Takeyama M, Shima M
    • Journal Title

      International Journal of Hematology

      Volume: 111 Pages: 369-377

    • DOI

      10.1007/s12185-019-02782-z.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] A new global assay for detection of protein C pathway-associated thrombophilia using thrombomodulin-mediated clot waveform analysis2020

    • Author(s)
      Naoki Hashimoto, Kenichi Ogiwara, Keiji Nogami, Midori Shima
    • Organizer
      International Society on Thrombosis and Hemostasis 2020
    • Int'l Joint Research
  • [Book] 新臨床内科学(第10版)第8章 血液・造血器疾患 血小板減少症以外の原因による出血傾向 6.その他の先天性凝固因子欠乏症2020

    • Author(s)
      荻原 建一,嶋 緑倫
    • Total Pages
      1
    • Publisher
      医学書院
    • ISBN
      978-4-260-03806-5

URL: 

Published: 2021-12-27  

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