Studies on the role of Ephrin-B2 and RARRES2 in replication of RS virus

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10133
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 白戸 憲也 国立感染症研究所, ウイルス第三部, 主任研究官 (40415477)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: RSウイルス / Ephrin-B2 / RARRES2

Outline of Annual Research Achievements

Ephrin-B2ノックアウト細胞について、いくつかのクローンが取れたと思われ、ウイルスの細胞侵入に関する実験を行っていたが、実験結果が極めて安定しないことに気づき、得られていたノックアウト細胞についてPCRによるバンド長確認、遺伝子配列の解析を行い、確実なノックアウト細胞のクローンが得られていないと判定した。このまま実験の継続を続けるのは意味がないので、再度ノックアウト細胞のクローンを得ることからやり直した。これまで使っていたシグマ社のCRISPR関連試薬では、3つのプラスミドを形質導入する必要があるが、肝心なCas9発現プラスミドの形質導入効率が極めて低く、形質導入条件の検討をいろいろ行ったが、十分な導入効率を得る条件が設定できなかったため、試薬そのものの変更を検討した。その結果、Thermo社の試薬が良さそうに思えたため、これらによるノックアウト細胞の最構築を行うことにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ノックアウト細胞の作製が完了したと考えていたが、完全ではなかった。ノックアウト細胞の再調整を行っている。

Strategy for Future Research Activity

シグマ社のCRISPR関連研究試薬は形質導入効率が極めて低く、その後のセレクションもかなりの困難を極めることが分かってきた。今後はCas9およびガイドRNAをプラスミドで発現可能であり、その後CD4分子のtransient発現でセレクションが可能なThermo社の試薬に切り替え、ノックアウト細胞の作製から再度挑戦している。

Causes of Carryover

順調に進んでいたと考えていたノックアウト細胞作製がうまくいっていなかったため、初年度からの繰り越しを含めてほぼ全額の費用を使うとこととなった。残金は7万円ほどで、目的の試薬を購入するには足りないので、次年度の予算と合わせて購入に使用される予定である。