2017 Fiscal Year Research-status Report

ヒトiPS細胞を利用した心臓領域特異的心筋細胞および心内膜細胞の誘導法開発

Research Project

Project/Area Number	17K10151
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	古道一樹慶應義塾大学, 医学部, 助教(有期) (10338105)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	芝田晋介慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70407089) 湯浅慎介慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90398628)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	心臓前駆細胞 / ゲノム編集 / iPS細胞 / 心臓領域
Outline of Annual Research Achievements	平成２９年度は初年度の計画に基づき、代表的な心筋細胞の起源である、第一および第二心臓領域由来心臓前駆細胞を単離するためのCRISPR/Cas9およびPiggyBacを用いたゲノム編集によるシステム構築を行ってきた。検討過程において、全心臓前駆細胞に発現する転写因子NKX2.5および一次心臓領域に発現する転写因子TBX5をマーカーとして各前駆細胞を選別する方法では、二次心臓領域由来心臓前駆細胞(NKX2.5+TBX5-)の占める割合が5%前後と非常に低率であったため、二次心臓領域由来心臓前駆細胞に発現する新たなマーカーを用いてソートする系を再構築する必要が認められた。そこで我々は、NKX2.5遺伝子を利用した全心臓前駆細胞の選別に加え、二次心臓領域由来前駆細胞に特異的に発現する転写因子ISL1の開始コドン直前にP2A配列を挟んでCre組み換え酵素を、またヒトにおける遺伝子発現のsafety siteであるPPP1R12C遺伝子のイントロン内に、EF1aプロモーター下にCre依存性にEGFPを発現するトランスジーンを挿入するための遺伝子組み換え用ドナーベクターを新たに構築した。また、従来のiPS細胞にプラスミドを導入するためのエレクトロポレーション法は、細胞死を惹起する率が高く、3種類のドナーベクターを導入し、薬剤選択するためにより細胞生存率の高いプロトコルを確立する必要が生じた。Lipofectamin3000を用いたリポフェクション法で条件検討を行った結果、エレクトロポレーション法に比して高率な細胞生存と50％以上のプラスミド導入効率を得ることが可能となった。本法を用いて、各1種類ずつのドナーベクターは問題なくゲノム編集可能であることを確認した。また、NKX2.5遺伝子の直前にP2A配列を挟んでturboRFPを導入したiPS細胞は、心筋分化過程で心臓前駆細胞に分化すると赤色蛍光を発現し、ゲノム編集によるトランスジーンの発現が問題なく起こることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 目的としている2種の心臓前駆細胞の内で、二次心臓領域由来心臓前駆細胞のソート効率が、TBX5遺伝子をマーカーとしてネガティブセレクションする場合、非常に低くなってしまい、新たな心臓領域特異的マーカー遺伝子としてISL1を用いて、異なる系の作製が必要となったため。
Strategy for Future Research Activity	本年度はさらに、3種のドナーベクターを同時にゲノム編集し、二次心臓領域由来心臓幹細胞を効率的にソートするレポーターiPS細胞を樹立後、各心臓領域特異的心臓前駆細胞および心筋細胞の表現型解析を進める。また本年度より、心内膜細胞マーカーとなるNFATC1およびPECAM遺伝子発現に従い、蛍光蛋白を発現する、ヒト心内膜細胞選別用iPS細胞の作製を同時に進めていく予定である。
Causes of Carryover	高額のiPS細胞培養関連製品を購入不可能な1万円未満の少額の残金が発生したが、次年度の消耗品代として使用予定である。