2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of induction protocol for cardiac field-specific cardiomyocytes and endocardial cells using human iPS cells
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17K10151
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
古道 一樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芝田 晋介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70407089)
湯浅 慎介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90398628)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心臓前駆細胞 / ゲノム編集 / iPS細胞 / 心臓領域 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は、二次心臓領域心臓前駆細胞の標識に関して、新システムの構築を試みた。蛍光タンパク自体の問題、P2Aにより産生される蛍光タンパク融合転写因子の問題ともに原因を特定困難であったため、蛍光タンパクをturboRFPからmRubyに、蛍光タンパクと転写因子の同時発現にP2Aではなく、IRES2を用いたmRuby-IRES2-NKX2.5 transgeneを作製した。ヒトコントロールiPS細胞への遺伝子導入は成功したが、Piggybac systemを用いたselection markerの除去は研究期間内に完了することができなかったため、現時点で、同システムによりiPS細胞が心筋に分化する過程でmRubyタンパクを発現するかどうかは未確認である。また、triple transgenic reporter cell lineを構築する過程で、三度の遺伝子導入を行う必要があり、頻回の遺伝子導入とそのセレクションの際に、細胞に加わるストレスから細胞の多能性が失われていく現象が問題となった。そのため、Cre-loxP systemを用いたEGFP発現システムを断念し、先に述べたmRuby-IRES2-NKX2.5 transgeneと同様に、EGFP-IRES2-ISL1 transgeneを作製し、double transgenic reporter systemへと変更する必要性が生じた。心内膜細胞ソートシステムについては、turboRFP-P2A-PECAM transgeneは完成し、iPS細胞への導入、セレクションマーカーの除去を完了した。現時点で、内皮細胞への分化過程で明らかな蛍光発現は認められていないため、今後の検討で、心臓前駆細胞と同様にIRES2を用いたシステムへと変更を必要とする可能性がある。iPS細胞へのゲノム編集は問題なく行えたが、転写因子発現量の減少を防ぐために用いたP2Aが正常に作動しない現象により、IRES2システムの使用が望ましい可能性が示唆される結果となった。
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