2018 Fiscal Year Research-status Report
早産起因細菌に対する宿主細胞感染防御メカニズムの解析
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17K10201
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| Research Institution | Osama Woman's and Children's Hospital |
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Principal Investigator |
西海 史子 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 流動研究員 (60599596)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | U. parvum / ER stress |
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| Outline of Annual Research Achievements |
わが国では年間 6 万人余りが早産（妊娠 22 週から 37 週未満）で出生し、早産率は約 6% である。早産児の原因の約半数に細菌感染や、病理的な絨毛膜羊膜炎（CAM）が認められる。感染性早産は臨床的に抗菌薬の効果は低くその制御は今尚困難である。当センター流早産胎盤における Ureaplasma spp.の分離頻度は42%であり、CAM の起因微生物として最も重要な細菌の一つである(Namba et al., Ped Res, 2010)。ウレアプラズマの宿主細胞への感染実験で、ウレアプラズマ感染によるERストレス反応が引き起こされることが明らかになった。今回、ウレアプラズマのゲノムDNA解析の結果、機能未知遺伝子がいくつかあり細胞膜障害性毒素の機能を持つ遺伝子について解析を行った。細胞膜障害性毒素の機能を持つ遺伝子の一つであるU403 の機能解析を行うために、培養細胞にこの遺伝子を過剰発現させたところ細胞死が引き起こされることが示された。このU403を安定発現する細胞株を2種類の細胞株種 (HeLa, CaSki) で作製しU. parvumが常時感染しているのと同じような状態にした時ERストレス関連因子の発現上昇が確認されるか調べたところ、U. parvumを感染させた時と同じタンパク質の発現上昇、miRNAの発現上昇が示された。ウレアプラズマ感染によってアポトーシスの誘導が抑えられると感染細胞の不死化が起き、癌が誘導されるのではないかと考えられることから、U403を安定発現する細胞を用いて抗癌剤（Actinomycin D, Cisplatin, paclitaxel）に対する抵抗性について解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウレアプラズマのゲノムDNA解析の結果得られた細胞膜障害性を引き起こす機能未知遺伝子 (U403) の解析を行うために、培養細胞にU403を過剰発現させたところ細胞死が引き起こされることが示された。U403の機能解析を行うために、U403を安定発現する細胞株 (HeLa, CaSki) を作製しU. parvumが常時感染しているのと同じような状態にしてERストレス関連因子の発現上昇が確認されるか調べたところ、U. parvumを感染させた時と同じタンパク質 (Bip PERK, IRE1α,P-eIF2αの発現上昇が確認された。U403発現細胞でPERKの発現上昇が確認されたことからmiR-211, miR-214の発現が誘導されているかDigital PCRで調べた結果、miRNA-211, miR-214の発現上昇が確認された。miR-211の発現が誘導されるとアポトーシス促進性の転写因子chopの発現を抑えることが報告されている。WBの結果で感染細胞やU403発現細胞でchopの発現が抑えられていたことから、これらの細胞でアポトーシスの誘導が抑えられ、細胞の不死化が誘導されて癌化するのではないかと考えられる。そこでU403を発現する細胞を用いて抗癌剤やX-ray 照射に対する抵抗性についてcell viability assay及びcolony formation assayで検証を行った。その結果、U403を安定発現する細胞はこれらの抗癌剤やX-ray照射に対してコントロールの細胞よりも細胞死に対する抵抗性が示された。これらの結果から、ウレアプラズマ感染によってアポトーシスの誘導が抑えられた細胞は、細胞の不死化が引き起こされ癌が誘導されやすくなり、感染細胞が抗癌剤抵抗性を示したことから癌化しやすくなっていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
U 403を安定発現する細胞でmiR-211, miR-214の発現上昇が確認されたことから、miR-211、miR-214のinhibitorを用いてこれらの発現を抑えるとアポトーシス関連因子の発現が誘導され、アポトーシスが引き起こされるか検証する。さらにU403を安定発現する細胞用いて抗癌剤に対する抵抗性について調べたところ、コントロールと比較してU403発現細胞で抗癌剤抵抗性を示したことから、Nude miceにU403を発現する細胞をxenograftし、腫瘍を形成させてU. parvum由来U403の抗癌剤に対する抵抗性についてin vivoの系で調べる。抗癌剤の抵抗性については、腫瘍の大きさを調べて検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度に購入する試薬等に使用する為に、次年度使用額が生じた。機能未知遺伝子の機能解析を行うために必要な消耗品やマウス等購入費用として40万円。
学会参加発表する為の参加費及び旅費として 10万円。人件費・謝金として10万円、その他諸経費として10万円。
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