2017 Fiscal Year Research-status Report
疾患特異的iPS細胞を用いたブラウ症候群の病態解明と治療法開発
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17K10243
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
川崎 ゆり 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (70507079)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ブラウ症候群 / NOD2 / 自己炎症性疾患 / RNA-seq / IFN-γ / NF-κB / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
A.RNAシーケンスの結果からパスウェイ解析を実施する
4種類のiPS-ML細胞を各々マクロファージに分化誘導（iPS-MP細胞）し、それぞれインターフェロンγ（IFN-γ）および ムラミルジペプチド（Muramyl Dipeptide; MDP）で刺激したサンプルからRNAシーケンスを実施していた。この結果を用いて、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 解析や遺伝子発現量の比較等を実施して、遺伝子変異特異的・刺激特異的に発現が変動する遺伝子を抽出することができた。更にRNAシーケンスの結果をもとにパスウェイ解析を実施した。解析結果より、変異遺伝子をもつ細胞内での特異的な経路が特定されてきた。これらの結果は、変異遺伝子により通常でも炎症が活性化状態にあることを示唆するものであり、病因の解明には有意義なデータを得ることができた。
B.NOD2タンパク質の細胞内での局在を経時的に観察する
I)NOD2遺伝子に3×FLAG-tagを付加したものを作製し、iPS細胞にCRISPR-Cas9システムで導入した。導入後の各iPS細胞からiPS-MP細胞を誘導し、それぞれIFN-γおよびMDPで刺激した後、経時的に細胞をサンプリングした。
II)次に、以下のⅰまたはⅱの方法でNOD2タンパク質の局在を時間的・空間的に観察した。(i).免疫染色：サンプリングした細胞を固定し、3×FLAG-tagを目印に蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。(ii).ウエスタンブロッティング法：サンプリングした細胞からタンパク質を抽出し、3×FLAG-tagを標識抗体で検出することにより、NOD2タンパク質の存在を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
3×FLAG-tagをNOD2タンパク質のC末に付加したものを作製したのだが、このC末の3×FLAG-tagが、本来のNOD2遺伝子の機能に影響を及ぼしている可能性が生じてきた。そこで、3×FLAG-tagをN末に付加したものを作製中であるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNAシーケンスの解析は更に発展させ、遺伝子変異の下流で動きのある遺伝子群の特定を目指し、発現変動した遺伝子どうしの前後関係やネットワークについても迫る予定である。
N末に3×FLAG-tagを付加したNOD2タンパク質を発現する細胞を用いて、NOD2タンパク質の細胞内での局在、更にはNOD2タンパク質と相互作用する因子を探索する予定である。
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