疾患特異的iPS細胞を用いたブラウ症候群の病態解明と治療法開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10243
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 川崎 ゆり 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (70507079)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ブラウ症候群 / NOD2 / iPS細胞 / IFN-γ / 自己炎症性疾患

Outline of Annual Research Achievements

A.RNAシーケンスの結果からパスウェイ解析を実施する
4種類のiPS-ML細胞を各々マクロファージに分化誘導（iPS-MP細胞）し、それぞれインターフェロンγ（IFN-γ）および ムラミルジペプチド（Muramyl Dipeptide; MDP）で刺激したサンプルでRNA-seqを実施していた。この結果を用いて、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 解析や遺伝子発現量の比較等を実施して、遺伝子変異特異的・刺激特異的に発現が変動する遺伝子を抽出することができた。更にRNA-シーケンスの結果をもとにパスウェイ解析を実施した。解析結果より、変異遺伝子をもつ細胞内での特異的な経路が特定できた。これらの結果は、変異遺伝子により通常でも炎症が活性化状態にあることを示唆するものであり、病因の解明には有意義なデータを得ることができた。
B.NOD2タンパク質の細胞内での局在を経時的に明らかにする
I)変異NOD2遺伝子には3×FLAG-tagを付加し、正常NOD2遺伝子には3×HA-tagを付加したベクターを作製し、iPS細胞にCRISPR-Cas9システムで導入した。導入後の各iPS-ML細胞からiPS-MP細胞を誘導し、それぞれIFN-γおよびMDPで刺激した後、細胞をサンプリングした。
II)次に、以下の(ⅰ)または(ⅱ)の方法でNOD2タンパク質の所在を時間的・空間的に観察した。(i).免疫染色：サンプリングした細胞を固定し、3×FLAG-tagを目印に蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。(ii).ウエスタンブロッティング法：サンプリングした細胞からタンパク質を抽出し、3×FLAG-tagと3×HA-tagを標識抗体で検出することにより、NOD2タンパク質の確認を試みた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

3×FLAG-tagをNOD2タンパク質のC末に付加したものを作製したのだが、このC末の3×FLAG-tagが、本来のNOD2遺伝子の機能に影響を及ぼしている可能性が生じてきた。そこで、3×FLAG-tagをN末に付加したものを作製することにした。この時、変異タンパク質と正常タンパク質を区別して観察できるように改良し、変異NOD2タンパク質には3×FLAG-tagを、正常NOD2タンパク質に3×HA-tagを付加する戦略をとった。3×FLAG-tagと3×HA-tagは目的の場所にゲノム遺伝子を傷付けることなく導入したものを完成させることができた。しかし、遺伝子レベルでは完璧であったが、タンパクと質としての発現がまだ確認できておらず、この問題を解決するのに時間を要している状態である。

Strategy for Future Research Activity

tagの付き方が異なる細胞を数種類作製しているので、これらをを駆使して、NOD2タンパク質の動態を明らかにしていく。