色素細胞特異的な白斑誘導物質の細胞障害性評価系の確立と障害メカニズムの解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10248
• Research Institution: Gifu Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 井上 紳太郎 岐阜薬科大学, 薬学部, 特任教授 (00793853)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水谷 有紀子 岐阜薬科大学, 薬学部, 特任准教授 (30396296) ; 石塚 麻子 岐阜薬科大学, 薬学部, 研究補佐員 (50727203)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ロドデノール / メラノーマ / 化学白斑 / 酸化ストレス

Outline of Annual Research Achievements

ロドデノール(RD)含有の美白化粧品使用者に、尋常性白斑と類似した色素脱失症が出現した。RDがチロシナーゼ活性依存的にメラノサイト特異的な細胞障害を惹起すること、NRF2酸化ストレス応答系がグルタチオンの産生を介して細胞障害を防御することを見出し、両者のバランス破綻が色素脱失発症の要因である可能性を示した。しかし、正常メラノサイトでは、用いる細胞株や培養条件（背景因子）の違いによってRD障害性を示さない問題点があった。本研究は、RDなどの白斑発症リスク化合物を安定評価できる遺伝子改変メラノーマ株を作出して汎用性の高い細胞評価系を確立し、白斑発症におけるメラノサイト障害メカニズム解明により診断・予防・治療法を提案することを目的とした。
ヒトメラノーマを10株以上使用し、RDに対する細胞障害性/細胞増殖抑制作用を検討した結果、1mM以下のRDに感受性を示す細胞株は存在しなかった。そこで、培養時における血清添加量、チロシナーゼ発現能、グルタチオン合成能、あるいはオートファジー活性の制御や、細胞株に混在が予想されるアメラノティックメラノーマ細胞（メラニン合成能がなく増殖能の高いメラノーマ細胞）除去などを順次試み、単独因子の条件変更で、RDに対する細胞障害性を増強できないかを検討中である。
細胞内の酸化ストレスに対する抵抗性に寄与する大きな要因の一つはNRF２系と考えられる。メラノーマ細胞のNRF2ノックアウト（KO）により、他の感受性に対する個別の評価がしやすくなると考え、細胞増殖性やチロシナーゼ発現に問題のないA2058株を選択し、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりNRF2遺伝子のKO株を作製した。現在、複数のクローン株についてNRF2遺伝子の配列、タンパク質発現、mRNA発現、チロシナーゼ発現などの性質を調べ、今後の解析に用いるクローン細胞を選択している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

以前の研究で、ヒト正常メラノサイトでは、用いる細胞株や培養条件の僅かな違いによってもRD障害性を示さない問題点があり、白斑発症リスクのある化合物を安定評価できる系として用いることは困難であった。これは、チロシナーゼ発現、抗酸化系の能力ほか、複数の背景因子の影響によると推定された。
この複数要因を解析するには正常メラノサイトではなく、遺伝子改変可能なメラノーマ株を用いることが有用と考え、まず標準の培養条件下でRDに高感受性を示すメラノーマ株の選択を実施したが、１０株以上のメラノーマ株を調べても期待に反して低濃度でRDの細胞障害性を評価できるような細胞株は得られなかった。その原因として、メラノーマ細胞はそもそもヘテロな細胞集団であり、メラニン合成能をもたない細胞増殖能の高い細胞（アメラノティック細胞）が存在している可能性や、複数の抗酸化システムが寄与している可能性が考えられた。そこで、チロシナーゼ発現能、抗酸化能、オートファジー能の制御に加えて、メラノーマ細胞株に混在が予想されるアメラノティックメラノーマ細胞（メラニン合成能がなく増殖能の高いメラノーマ細胞）の除去など、障害性に関わる諸条件が、RDの細胞障害性を高めるか否かの検討を実施している。
以上の経緯の通り、ゲノム編集に用いるメラノーマ細胞の選択に時間を要し着手に後れを生じたため、少なくとも細胞増殖とチロシナーゼ発現に問題のメラノーマ株としてA2058株をモデルメラノーマ細胞株として選択し、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集によりNRF2遺伝子のKO株を作製し、現在そのキャラクタライゼーションに取り組んでいる。

Strategy for Future Research Activity

第一優先として、ゲノム編集により作製した複数のクローンのNRF2遺伝子のKO株を用い、RD細胞障害性を評価できる細胞株を選択して、先ずは化学白斑や尋常性白斑を発症させることが臨床的に明らかになっている化合物の検出が可能かどうかを検討する。対象となる化合物は、RDの他、ヒドロキノン、モノベンゾン、t-ブチルフェノールなどのフェノール性化合物である。さらに、白斑発症が報告されていないフェノール性化合物（コーヒー酸、クマル酸、チロソール、レスベラトロールなど）、非フェノール性だが白斑発症が報告されている化合物（スルフィドリル化合物、ベンジル化合物、フェルフェナジン、アザレイン酸など）についても検討を予定している。この時、元のメラノーマ株はヘテロな細胞集団と考えられるので、ゲノム編集後にクローン化する過程で、NRF2をKOできなかったクローンについても、チロシナーゼ発現＋でかつNRF2+のコントロール細胞株として利用できるか否かも考慮する。
さらに、RD細胞障害性に影響を与えるNRF2系以外の標的分子を評価することで、そもそも化学白斑を発症しやすいリスク要因を探りたい。その候補分子としては、オートファジーの活性化や抑性に関わる分子、ERストレス誘導に関わる分子、NFκBの活性化に関わる遺伝子、NRF2以外の抗酸化分子、およびt-ブチルフェノールの白斑リスクの要因として提案されているTRP１などを予定している。
これらの検討により、化学白斑リスクをin vitroで評価できる系を確立し、さらに化学白斑や尋常性白斑発症リスクに暴露後に発症に至る個人差の要因（NRF2や他の抗酸化ストレス応答など）を明らかにすることで、白斑発症におけるメラノサイト障害メカニズムの解明、診断・予防・治療法の提案を目指したい。