microRNA導入幹細胞による新規放射線増感法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10476
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 松尾 圭朗 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (90749201)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤坂 浩亮 神戸大学, 医学部附属病院, 特命助教 (20707161) ; 宮脇 大輔 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (30546502) ; 犬伏 祥子 (カリヤ) 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (60585959) ; 江島 泰生 獨協医科大学, 医学部, 講師 (70423233) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 放射線増感

Outline of Annual Research Achievements

膵癌細胞株としては、MiapacaやPANC-1など複数の細胞株がこれまでの研究で用いられているが、既報告での使用経験か多く後述のmTORに関与した放射線増感の研究で用いられた実績のある、膵癌細胞株（PANC-1）を選択し、初代培養をおこなった。マイクロRNA expression vector トランスフェクションの際にはVectorがトランスフェクションされた際にG418（ネオマイシン)耐性を獲得することから、G418（ネオマイシン)でセレクションを行う。このため、G418（ネオマイシン)作用適正濃度の検討をおこなった。0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/mlまでのそれぞれの濃度で検討を行った結果、0.5mg/ml作用細胞で50%死滅が確認され、これより0.8mg/mlでのセレクションを行う方針とした。次いで使用するマイクロRNAの選別を行ったが、mTOR kinaseのdown regurationによる電離放射線感受性を示すmiR99bやその過剰発現がE-カドヘリンレベルの発現を増強し、膵癌腫瘍増殖速度を低下させるmiR101-1、その他miR144を選択し、今後はPANC-1膵癌細胞へのトランスフェクションを行ったのち、リアルタイPCRおよびウエスタンブロッティング法による発現確認し、電離放射線の照射を行っていく予定である。これらのマイクロRNAによる放射線増感が確認されれば、次は脂肪由来間葉系幹細胞にmicroRNAのトランスフェクションを行い、PANC-1と共培養を行ったうえで同様の手順で増感作用を確認する予定としている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ウエスタンブロッティングの化学発光検出・記録に用いるゲル撮影装置の故障のため、再購入を行い、やや遅延した。また、microRNAが多種にわたっており、その選別に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、In vivoでの研究を継続する。PANC-1細胞へのmiRのトランスフェクション・発現の確認・電離放射線の照射を行う。なお、本施設でのX線照射装置が利用困難となったため、粒子線治療装置で代替を行う予定である。

Causes of Carryover

ウエスタンブロッティングの際に用いるゲル撮影装置の不具合のため、新規購入が必要となり、前倒し請求を行った。その後、microRNAの購入を行う予定であったが、すでに数千種をこえる種類が報告されているmicroRNAの選別に時間を要してしまい、H29年度内に購入することができなかった。次年度使用額として繰り越した分で、当初の予定通りmicroRNAの購入を行う予定である。