2018 Fiscal Year Research-status Report

膵島移植における長期グラフト生着のための治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	17K10501
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	渡辺正明北海道大学, 医学研究院, 特任講師 (40789848)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山下健一郎北海道大学, 医学研究院, 特任教授 (00399940) [Withdrawn] 後藤了一北海道大学, 医学研究院, 特任助教 (10645287)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	膵島移植 / 細胞移植 / 免疫寛容
Outline of Annual Research Achievements	膵島移植は、膵臓移植と比較して圧倒的に低侵襲な1型糖尿病根治的治療法である。膵臓移植と遜色のない移植成績が得られつつあるものの、現状の免疫抑制法では、アロ膵島の長期生着は得られていない。膵島の単離精製過程での膵島障害、移植手技に伴う強い炎症反応が移植後早期に膵島障害を惹起し、これにより増強された獲得免疫応答が膵島グラフトを拒絶する。膵島障害の軽減法、膵島グラフト障害の機序は未だ十分には開発・解明さておらず、移植膵島の長期生着をもたらす新たな治療法の確立にはその解明が不可欠である。本研究では膵島移植における、膵島グラフト障害の機序を明らかにするとともに、膵島移植の長期成績の劇的な向上をめざす新たな治療法として、ドナー抗原特異的な免疫抑制性細胞の治療効果を検討し、臨床応用へ繋げる基礎研究である。平成29年度は、マウス膵島、マウス膵島移植モデルを用いて、自然免疫応答抑制法と免疫抑制性アナージー細胞輸注療法の併用が膵島移植の有効な治療法になり得るかを検証するため、ドナー抗原特異的な免疫抑制性アナージー細胞を誘導する上で、培養期間、細胞濃度、抗体濃度を比較検証し、最も免疫抑制性の高いアナージー細胞の誘導法を見出すことに主眼をおいてきた。本年度は、まず、技術的に難しい、マウス膵島の単離や移植技術の安定をはかるとともに、マウスマクロファージの単離の技術を確立することができた。マウスでのCD80/86抗体の確立にやや時間を要したが、ようやく使用可能な状況となり、目下、最も効果的な免疫抑制性の細胞を誘導する培養期間、細胞濃度、抗体濃度を比較検証を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 技術的に難しい、マウス膵島の単離や移植技術の安定をはかるとともに、免疫寛容細胞の誘導を行なっている。マウスマクロファージの単離の技術を確立することができているが、マウスでのCD80/86 抗体の確立にやや時間を要している。ようやく使用可能な状況となっているが、効果的な免疫抑制性の細胞を誘導する培養期間、細胞濃度、抗体濃度を比較検証にやや時間を要している。この条件設定が完了次第、in vitro, in vivoでの検証を開始する。
Strategy for Future Research Activity	最も有用な方法で誘導されたドナー抗原特異的な免疫抑制性アナージー細胞をex-vivoで誘導し、誘導された細胞をマウスアロ膵島移植モデルでのレシピエントに膵島移植後に輸注し、膵島グラフトの生着期間延長効果を検証する。糖尿病マウスは、ストレプトゾトシンで糖尿病誘導する。糖尿病B6マウスに、BALB/cマウス膵島を肝臓内に経門脈的に移植し、生食のみ投与のコントロール群、輸注細胞投与群で、膵島グラフトの生着期間を血糖で検討する。移植後の膵島グラフト機能を静脈内グルコース投与試験で検討し、免疫学的検討として、移植後のレシピエントの脾臓細胞を用いてMLR、IFN-γ ELISPOT assay、移植後14日目に移植後の肝臓内の移植膵島を免疫組織学的に検討し、細胞浸潤の有無を検討する。(いずれも応募者の以前の研究方法を踏襲する。Watanabe M Transplantation 2013)さらに、応募者がこれまでに検証した、炎症を制御する方法論を併用することで、少ない膵島数(200 個のBALB/cマウス膵島)でも生着期間の延長効果が得られるかを同様の方法で検証する。なお、これらの結果をもとに前臨床試験としての霊長類膵島移植実施に向けた具体的なプロトコルを作成する。
Causes of Carryover	抗原特異的な免疫抑制効果を有する細胞集団を誘導する上で、細胞の培養条件設定により、誘導細胞に差があることが見出され、追加で培養条件設定のための培養皿の選定等を行った。これに伴い、当初予定していた経費の消費が遅くなり、53261円を次年度に使用することとなった。再現性を確認後に、当初の予定通り解析を進める予定である。