抗原性を消失させた肝細胞シート移植による免疫寛容導入の試み

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10516
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 高槻 光寿 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (80380939)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池田 裕明 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (40374673)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肝移植 / 拒絶回避 / ゲノム編集 / MHC分子 / 細胞シート

Outline of Annual Research Achievements

臓器移植や組織移植においては拒絶反応の制御が必要である。拒絶反応は、腫瘍組織適合抗原(major histocompatibility complex：MHC)のうち主にMHC class Iが標的となる。そこで、拒絶を回避するために、抗原であるドナー細胞のMHC発現の抑制に着目した。本研究では、肝細胞シート移植において、移植した肝細胞表面のMHC class I発現を抑制することで、拒絶反応を起こさず長期生着させることを目的とする。
方法として、CRISPR/Cas9システムを用い、MHC class I発現を抑制するためのゲノム編集を行う。肝細胞株、さらにヒト初代肝細胞に、ウイルスベクター法や電気穿孔法などで遺伝子導入を行い、MHC発現抑制細胞を作製し、このMHC発現抑制肝細胞をシート化してマウスへ移植し、長期生着し機能維持できるか否かを検討する。
MHC classⅠ発現抑制のため、β2ミクログロブリン遺伝子に対するガイドRNAを設計し、プラスミド、さらにレンチウイルスベクターを作製した。肝細胞株(HepG2)にウイルスベクター法、リポフェクション法、電気穿孔法など種々の遺伝子導入法を試みた。リポフェクション法、電気穿孔法ではMHC発現の抑制が確認できなかったが、ウイルスベクター法では10～15%のMHC発現抑制が確認できた。さらにMHC分子を抑制したHepG2を磁気細胞分離し、MHC抑制細胞を約90%と高純度に回収し、細胞シートを作製することができた。また、ヒト初代肝細胞においても同様にウイルスベクター法にてMHC発現を抑制することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度の計画は、ヒト初代肝細胞分離を行うこと、またMHC発現を抑制するためのゲノム編集を行うことであった。目的とするウイルスベクターを作製し、CRISPR/Cas9システムを用いて、MHC classⅠ分子を抑制した肝細胞を作製することができた。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、ウイルスベクターによる遺伝子導入により、MHC class I分子を抑制した肝細胞を作製する。さらに、高純度のMHC抑制細胞シートを作製する。アロリンパ球との共培養を行い、MHC分子を抑制することで抗原性が低下しているか否かを検証する(in vitro)。また、この細胞シートをマウスへ移植し、拒絶反応の有無と肝細胞機能を評価する(in vivo)。

Causes of Carryover

今年度はウイルスベクターの作製を行い、遺伝子導入効率の確認を行った。導入効率が確認できたため、同ウイルスベクターで研究を継続する予定であり、次年度予算においてウイルスベクターを追加購入する。さらに、各種アッセイに必要な抗体、培地を購入し、in vitroでの評価を行う。また、今後のマウスへの移植にむけて、マウスを購入する予定である。