2018 Fiscal Year Research-status Report
外科侵襲における脂肪組織のミトコンドリア/小胞体ストレス誘導性アポトーシスの解明
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17K10526
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
松谷 毅 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50366712)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
萩原 信敏 日本医科大学, 医学部, 講師 (00328824)
松田 明久 日本医科大学, 医学部, 助教 (00366741)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 小胞体ストレス / アポトーシス / PPAR-γ－アゴニスト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
外科的侵襲によってマクロファージが浸潤した腹腔内脂肪組織にアポトーシス細胞を認め，その機序としてミトコンドリアによる酸化ストレスや小胞体ストレスが関与していることを明らかにする．さらにPPAR-γ－アゴニストを用いて脂肪細胞の核内受容体を活性化することにより，外科的侵襲時の脂肪細胞・マクロファージ機能の変化による小胞体・酸化ストレス誘導性アポトーシスへの影響を解明する．具体的には，①マウス腹膜炎モデルから採取した腹腔内脂肪組織から脂肪細胞と間質細胞を分離し，外科的侵襲によって各細胞における酸化および小胞体ストレス誘導性アポトーシスが起きるかを検討する．②PPAR-γ－アゴニスト投与が，小胞体とミトコンドリア機能を変化させアポトーシス経路へ影響するかを検討する．
マウスCecum ligation and puncture（CLP）モデルを用いて腹腔内脂肪組織を採取し，浸潤したマクロファージを含む間質細胞と成熟脂肪細胞を単離する．各細胞を用いて小胞体ストレス誘導性アポトーシス関連転写因子C/EBP-homologous protein（CHOP）と小胞体分子シャペロンGRP78（BiP）の誘導をRT-PCR法と免疫組織化学染色法で検討する．脂肪細胞と間質細胞が接触することによってアポトーシスが誘導するのか，間質細胞と脂肪細胞が産生する液性因子によって互いに活性化されてアポトーシスが誘導されるのか，in vitroで検討する．さらにアポトーシスに伴いミトコンドリアではCaspase活性物質であるシトクロムCなどが放出し，電子伝達系の変化から膜電位差が消失するので，親油性・陽イオンの蛍光色素を使用して定性・定量的に解析する．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウスCLPモデルにおいて，脂肪組織中の循環型セリンプロテアーゼインヒビターα1-antitrypsin (臓器保護作用を示す)発現を解析した．さらに，in vitro敗血症モデルとして培養ヒト脂肪細胞株SW872培養系に小胞体ストレス惹起因子を処置した．敗血症誘起マウスの脂肪組織内セリンプロテアーゼインヒビターα1-antitrypsin発現量は，肝臓と比べ高値であったが，Sham群と比較して低下していた．脂肪細胞培養系におけるIL-6発現並びに分泌量は小胞体ストレス惹起因子タプシガルギン処置で促進され，この上昇はセリンプロテアーゼインヒビターα1-antitrypsin処置により抑制された．小胞体ストレス惹起因子タプシガルギンは，脂肪細胞の構成的IL-1β, IL-6, IL-8発現量を著しく上昇させた．この小胞体ストレス惹起因子タプシガルギンによる上昇はセリンプロテアーゼインヒビターα1-antitrypsinノックダウンにより増強され，またTNFα誘導性の炎症性サイトカイン量も増加させた．内臓脂肪細胞においてセリンプロテアーゼインヒビターα1-antitrypsinが発現し，過剰なアディホカイン産生を抑制していることが示唆された．
小胞体ストレス誘導性アポトーシスの実験系は順調だが，ミトコンドリア誘導性アポトーシスの実験系は結果がまだ出ていないため，やや遅れている．
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| Strategy for Future Research Activity |
雄性C57BL/6マウスに，吸入麻酔後，CLP群を作成し犠死させる．PPAR-γアゴニストをCLP施行前に7日間投与した群を作成する．腹腔内脂肪細胞と間質細胞を抽出し，外科的侵襲の影響のないマクロファージ様細胞（U937細胞）および培養脂肪細胞（SW872細胞）と腹腔内脂肪組織から単離した間質細胞との共培養法でもアポトーシスが誘導するのか，接触法と非接触法で検討する．ミトコンドリア誘導性アポトーシスとして，Mitochodria Isolation Kitを用いてミトコンドリアを単離し，親油性・陽イオンの蛍光色素JC-1を使用してミトコンドリア膜電位差の検出を行う．同時に各細胞を用いて小胞体ストレス誘導性アポトーシス関連転写因子C/EBP-homologous protein（CHOP）と小胞体分子シャペロンGRP78（BiP）の誘導をRT-PCR法と免疫組織化学染色法で検討する．
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| Causes of Carryover |
平成30年度は，全て物品費に使用した．一部値段との差が生じたためと，必要な物品が欠品していたなどで差額が生じた．発票学会が東京であったため出張費は生じなかった．平成31年度は，実験では物品費を中心に使用し，さらに論文作成などで必要な費用で使用する予定である．
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Research Products
(4 results)
