2018 Fiscal Year Research-status Report
乳癌悪性化を担うTRIMファミリー蛋白質の作用メカニズムと臨床応用
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17K10571
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
東 浩太郎 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (30401110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 聡 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究部長 (40251251)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 乳がん / ホルモン療法耐性 / 治療抵抗性 / TRIM25 / TRIM44 / TRIM47 / NFkappaBシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究においては、TRIM(Tripartite Motif)ファミリー蛋白質を切り口として、新たな乳がん悪性化・治療抵抗性にかかわる分子メカニズムの解明とその応用を目指している。
昨年度に、臨床検体を用いた検討においてTRIM44、TRIM47が乳がんの予後不良因子であることを示したことを踏まえ、平成30年度はそれぞれの分子の機能解析を進めた。
それぞれの分子のN末に、Flag-Mycエピトープを付加したコンストラクトを作成し、それらを乳がん細胞株MCF7に発現させた。細胞溶解液をFlagおよびMycの抗体により逐次的に免疫沈降を行うことにより、結合蛋白質を精製した。質量分析を用いた解析により、陰性コントロールとのスコアに差の生じた蛋白質に関しては、HAエピトープを付加したコンストラクトを作成し、HEK293細胞にTRIM44もしくはTRIM47と共発現させた。また、TRIM47に含まれる核内受容体結合配列に着目し、複数の核内受容体もTRIM47結合蛋白質の候補に加え、HAエピトープを有するコンストラクトを作成した。
免疫沈降法およびウエスタンブロッティングにて相互作用を確認したところ、評価した蛋白質のうち10種以上の蛋白質が結合蛋白質として確認された。
TRIM47に関しては、機能解析の一環として、マイクロアレイによる発現遺伝子の変化を解析した。乳がん細胞株MCF7において、siRNAを用いてTRIM47発現を抑制した際の遺伝子発現変化を包括的に解析することにより、TRIM47の抑制により発現が誘導される遺伝子群を同定した。定量的real-time PCR法により、誘導が確認できた遺伝子の中には、NFkappaBシグナルによって抑制される遺伝子が含まれており、TRIM47のNFkappaBシグナル活性化作用を裏付ける結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究対象としているTRIM44、TRIM47の結合蛋白質を複数同定することができ、乳がん悪性化のメカニズムを解明する手掛かりを得ることができた。さらに、TRIM47のNFkappaB活性化作用のエフェクターとなる候補遺伝子を複数同定し得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
TRIM47はRINGドメインを有するE3ユビキチンリガーゼであり、TRIM44は脱ユビキチン化酵素であることが報告されている。結合蛋白質は、基質同定の手掛かりになると考えられ、結合蛋白質の修飾状態、安定性等を解析予定である。また、結合蛋白質の乳がん患者における発現を調べることにより、予後因子および治療標的になる可能性を検討する。最終的には、マウスを用いたプレクリニカルな治療を行い、効果や有害事象を評価し、臨床応用につなげる。
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| Causes of Carryover |
本実験計画においては、初年度に多くの出費を予定していたが、臨床病理学的な解析を優先させたため、初年度の使用額が予定よりも少額となった影響で、本年度も次年度使用額が生じた。次年度以降は、動物を用いたプレクリニカルな検討を予定しており、動物購入費やsiRNAによる高額な出費が予想される。本年度までの出費を抑えることができたため、次年度以降に使うことができる金額が増え、このためさらなる研究の加速が期待できる。
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