2018 Fiscal Year Research-status Report
Lenti-CRISPR感染リンパ節転移モデルを用いた転移支配遺伝子の探索と制御
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17K10577
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
本山 悟 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (60292372)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 雄亮 秋田大学, 医学系研究科, 講師 (10431628)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | リンパ節転移モデル / in vivo passage / Lenti-CRISPR library |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①マウス口腔由来の扁平上皮癌細胞株を、マウスへ移植し、転移したリンパ節から分離したがん細胞をさらに次のマウスへ移植した(In vivo passage)。
前年度までにin vivo passageの継代数が進むにつれて腫瘍増殖速度とリンパ節転移頻度が上昇する高頻度リンパ節転移モデルを構築した。今年度はin vivo passageによって得られた高頻度リンパ節転移癌細胞にLenti-CRISPR libraryを導入し、これをマウスへ移植し、原発腫瘍の増殖、リンパ節転移の形成能について評価した。Lenti-CRISPR library導入癌細胞の原発腫瘍組織ならびに転移リンパ節からgenome DNAを抽出し、guide RNA配列を増幅したNGSライブラリーを作製し、次世代シーケンスへ提出した。
②RNAメチル化のN6-メチルアデノシン(m6A)に着目し、m6A脱メチル化酵素のリンパ節転移に与える影響について詳細な解析を進めた。
前年度までにm6A脱メチル化酵素はヒト食道扁平上皮癌細胞の増殖を制御することが分かったが、細胞周期の解析からG1からS期への進行に不可欠であることが分かった。RNA-seqによる m6A脱メチル化酵素ノックダウン細胞の遺伝子発現解析により、m6A脱メチル化酵素の標的遺伝子候補を同定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高頻度リンパ節転移モデルにおけるin vivo CRISPR screeningのwet解析のパートを完了させることができた。現在、次世代シーケンス解析中であり、次年度はシーケンスで得られたデータのdry解析により転移支配遺伝子を同定できる見込みである。また、m6A脱メチル化酵素によるヒト食道扁平上皮癌細胞の増殖制御のメカニズムも解明されつつあり、リンパ節転移巣における癌細胞の増殖に対する治療標的となることが期待される。以上より、本課題は、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①今後はシーケンスで得られたデータのdry解析によって転移支配遺伝子の候補を同定する。同定された候補因子について、CRISPR-Cas9によるノックアウトを行い、高頻度リンパ節転移モデルで検討する。
②ヒト食道扁平上皮癌細胞におけるm6A脱メチル化酵素の標的遺伝子候補について、m6A-RIPにより実際にmRNAのメチル化の制御を検討し、増殖制御のメカニズムを解明する。さらに、m6A脱メチル化酵素ノックダウン癌細胞のヌードマウスへの移植により、in vivo増殖におけるm6A脱メチル化酵素の役割も明らかにする。これらの解析によりリンパ節転移巣の増殖に対する新たな治療標的の探索を進める。
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