2018 Fiscal Year Research-status Report

次世代シーケンサーとデジタルPCRを用いた食道癌患者末梢血中ctDNAの検出

Research Project

Project/Area Number	17K10586
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	黒川幸典大阪大学, 医学系研究科, 助教 (10470197)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山崎誠大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (50444518)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	食道外科学 / ctDNA / 次世代シーケンサー / 分子バーコード
Outline of Annual Research Achievements	癌患者の血液中に存在する腫瘍由来遊離DNA(ctDNA)は、腫瘍の持つ遺伝子変異を簡便に診断するための非侵襲的検査法（liquid biopsy）として注目されている。本研究では、術前治療としてDCF療法および放射線治療を行った食道癌患者の末梢血を用いて次世代シーケンサー(NGS)によるctDNAの解析を行い、術前治療および手術によるctDNAの変化を解析することで治療効果予測や再発予測のマーカーとして臨床応用することを目的とする。前年度までの成果として、当院で術前治療を行った食道癌患者5例を対象に、術前治療開始前および手術前、手術後の血液検体、手術時の切除標本の腫瘍組織検体を採取し、それぞれのDNAを抽出した。本年度はこれらのDNAを用いてTP53遺伝子をターゲットとしたNGS解析を行った。手術標本検体5例のうち、3例でTP53遺伝子変異を認めた。これら3例のうち1例において治療前血液で同部位の変異を1.97%認めたが、手術前血液では認めなかった。残りの2例においては治療前、手術前血液共に原発で認めた変異を認めなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成30年度の計画としては、抽出したDNAをNGSにより解析することである。今回、当初の計画通り術前治療を行った食道癌切除症例5例に対し、切除標本検体および治療前、手術前血液より抽出したDNAをNGSにより解析を行った。結果は切除標本で5例中3例にTP53遺伝子変異を認め、それらのうち1例の治療前血液のみにおいて同部位の変異を1.97%に認めた。この結果は当初想定していた変異の検出感度を下回っており、臨床応用に向けてより高感度かつ網羅的なctDNAの解析が必要であると考えられた。そこで我々は分子バーコードを用いたNGSによるctDNA解析に着目した。現在、分子バーコードを用いたNGSの条件設定や前実験を進めている。以上より、平成30年度の計画としてはおおむね順調であり、来年度に向けての方針も定まっていると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	前述の通りより高感度かつ網羅的なctDNAの解析を行うにあたり、我々は分子バーコードを用いたNGSという手法に着目した。今後は採取した血液検体より抽出したDNAを用いて従来のNGSと分子バーコードを用いたNGSによる解析を行い、それぞれの検出感度の差について検討することを計画している。さらにこれらの検討により分子バーコードを用いたNGSが実臨床において十分に応用可能であることが証明されれば、更なるctDNA解析に応用する予定である。具体的には食道癌におけるTP53の変異の有無や部位、変異形式とDCF治療による治療効果（RECIST、内視鏡的効果、病理組織学的効果など）やその他臨床病理学的因子との関連についての検討。更に、DCF治療前後におけるctDNAの割合の変化と腫瘍径、組織型、臨床病気、その他臨床病理学的因子などとの関連性についても解析する。これらの解析により得られた結果から臨床応用の可能性が十分に期待できると考えられた場合、関連病院との多施設共同臨床研究グループにおいて、その有用性を検証するための新しい前向き臨床研究を計画する。
Causes of Carryover	次年度の研究費を用いて、従来のNGSおよび分子バーコードを用いたNGS解析を行う予定である。NGSやそのためのタグ付け、ライブラリ作成を行うには非常にコストがかかることが分かっている。また、解析の際に追加でDNA抽出が必要であると考えられ、それらのキットの購入にも本研究費を使用する予定である。