炎症性腸疾患関連癌の発癌関連性因子と生物学的特性解明のための基礎的検討

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10631
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 水島 恒和 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (00527707)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 宙 大阪大学, 医学部附属病院, その他 (00379207)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 自然リンパ球 / 大腸癌 / 炎症性腸疾患関連癌 / 炎症性腸疾患

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度は、手術症例の切除検体よりサンプルを採取し、自然リンパ球（ILC）を中心とした腸管免疫細胞の解析を行った。通常型大腸癌症例の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、Collagenase、Dispase、DNaseを用いて酵素処理を行い細胞を単離した後、Percoll密度勾配遠心分離を用いて腸管粘膜固有層単核球（LPMCs）および癌浸潤単核球を分離・採取した。これらをFACSで解析し、Lineage(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞でないリンパ球集団を展開した後、この中からILCのマーカーであるCD127陽性集団を確認した。ILCsはNKp44、HLA-DR、CCR6といった表面抗原マーカーを用いてさらに細かい分画に展開できた。NKp44+ILCsおよびNKp44-ILCsのサイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、NKp44+ILCsで高いIL-22のmRNA発現を認めた。
正常型大腸癌においては、正常粘膜部(n=10)と癌部(n=10)を比較すると、全リンパ球中のILCsの割合に差は認めなかったが（0.64% vs 0.38%, p=0.209）、細胞数は癌部で有意に多かった（3423 cells/g vs 13885 cells/g, p<0.01）。一方、癌部においては正常部と比較しILCの分画の変化が見られ、NKp44+ILCsの割合が減少していた(39.9% vs 18.4%, p=0.011)。
クローン病症例の切除検体の炎症部粘膜からも同様の手法でLPMCsを回収し解析した結果、非炎症性腸疾患（IBD）症例の正常粘膜部と比較し、リンパ球におけるILCsの割合に差は見られなかったが、ILCsにおけるNKp44+ILCsおよびHLA-DR+ILCsが減少傾向にあった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度は、手術症例の切除検体よりサンプルを採取し、自然リンパ球（ILC）を中心とした腸管免疫細胞の解析を行った。通常型大腸癌症例の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、Collagenase、Dispase、DNaseを用いて酵素処理を行い細胞を単離した後、Percoll密度勾配遠心分離を用いて腸管粘膜固有層単核球（LPMCs）および癌浸潤単核球を分離・採取した。これらをFACSで解析し、Lineage(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞でないリンパ球集団を展開した後、この中からILCのマーカーであるCD127陽性集団を確認した。ILCsはNKp44、HLA-DR、CCR6といった表面抗原マーカーを用いてさらに細かい分画に展開できた。NKp44+ILCsおよびNKp44-ILCsのサイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、NKp44+ILCsで高いIL-22のmRNA発現を認めた。
正常型大腸癌においては、正常粘膜部(n=10)と癌部(n=10)を比較すると、全リンパ球中のILCsの割合に差は認めなかったが（0.64% vs 0.38%, p=0.209）、細胞数は癌部で有意に多かった（3423 cells/g vs 13885 cells/g, p<0.01）。一方、癌部においては正常部と比較しILCの分画の変化が見られ、NKp44+ILCsの割合が減少していた(39.9% vs 18.4%, p=0.011)。
クローン病症例の切除検体の炎症部粘膜からも同様の手法でLPMCsを回収し解析した結果、非炎症性腸疾患（IBD）症例の正常粘膜部と比較し、リンパ球におけるILCsの割合に差は見られなかったが、ILCsにおけるNKp44+ILCsおよびHLA-DR+ILCsが減少傾向にあった。

Strategy for Future Research Activity

手術切除標本の腸管粘膜および癌間質よりLPMCsを分離・採取し、FACSを用いて各部位におけるILC細胞集団を確認した。ILCsはNKp44、HLA-DR、CCR6といった表面抗原マーカーを用いてさらに細かい分画に展開でき、NKp44+ILCsでは、高いIL-22のmRNA発現を認めた。通常型大腸癌において、正常粘膜部（n=10）と癌部（n=10）を比較すると、癌部においてNKp44+ILCsの割合は減少していた(39.9% vs 18.4%, p=0.011)。このような変化を確認できたので、今後は、通常型大腸癌の癌部におけるILCsやマクロファージ、樹状細胞といった免疫細胞のFACSによる解析を追加し、腫瘍部位（右側・左側）や深達度・進行度などの臨床病理学的因子との比較を行いながら通常型大腸癌における免疫環境の検討を進めていく。IBD非癌合併症例やIBD関連癌症例においては、症例を蓄積しながら、既に通常型大腸癌で確認できた分画のFACSによる展開・比較を行い、RT-PCRで各分画のサイトカイン産生能を評価していく。
IL-22 pathwayに関しては、IL-22、IL22-bp等の抗体による腸管の免疫染色で、産生細胞の局在および発現量を評価する。発現量の解析はRT-PCRでも行い、さらに、IL22誘導因子（TNFa、IL-23、LTa、LTbなど）やIL-22制御因子（IL-18、NLRP3、NLRP6など）の遺伝子発現も確認し、臨床病理学的因子との関連を解析する。
また、通常型大腸癌症例、IBD非癌合併症例、IBD関連癌症例の各組織からDNAを抽出し、MSI、miRNA発現の比較も行う。miRNA発現はマイクロアレイを使用し網羅的な解析を行い、発現差のあるmiRNAを同定する。

Causes of Carryover

（理由）FACS用抗体、細胞抽出用試薬、PCR関連試薬を購入し、今年度の実験に必要な物品を購入し終えたため。
（使用計画）引続き、上記同様FACSおよびPCRに必要な試薬や、マイクロアレイ関連試薬等を購入する予定である。臨床検体からの免疫細胞の分離・解析、免疫染色・RT-PCRを用いたIL22経路の臨床病理学的因子との関連の検討、IBDおよびIBD関連癌に関与するmiRNAの同定のために必要な物品である。