2018 Fiscal Year Research-status Report

炎症性腸疾患関連癌の発癌関連性因子と生物学的特性解明のための基礎的検討

Research Project

Project/Area Number	17K10631
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	水島恒和大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (00527707)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松田宙大阪大学, 医学系研究科, 講師 (00379207)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	自然リンパ球 / 大腸癌 / 腸炎関連大腸癌 / 炎症性腸疾患
Outline of Annual Research Achievements	平成29年度は、通常型大腸癌手術症例の切除標本よりサンプルを採取し、自然リンパ球（ILC）の解析を行った。切除標本の正常粘膜部・癌部より腸管粘膜および癌組織を採取し、酵素処理を行って細胞を単離し、腸管粘膜固有層単核球（LPMCs）および癌浸潤単核球を採取した。これらをFACSにて解析し、Lineage(CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20)-CD45+のT細胞・B細胞とは異なるリンパ球集団が存在することを確認した。さらに、この集団をCD56、CD127、CD117、CRTH2、NKp44といった表面抗原マーカーを用いて解析し、ヒト正常腸管粘膜および癌間質には様々な分画のILCが存在することが確認できた。正常大腸粘膜のILC分画の分布は、ヒト末梢血や腸間膜リンパ節、脾臓におけるILC分画の分布と全く異なっており、中でもCD127+CD117+NKp44+ ILCsが特異的に多く存在することがわかった。サイトカイン産生をRT-PCRを用いて評価したところ、同分画では高いIL-22のmRNA発現を認めた。平成30年度は、大腸正常粘膜部および癌部に存在するILC分画の比較を行った。癌部では、正常大腸粘膜と比較し、CD127-CD56+ ILCsおよびCD127+CD117+NKp44+ ILCsの割合が大きく減少し、CD127+CD117- ILCsの割合が増加していた。また、潰瘍性大腸炎（UC）の炎症部では、非炎症部と比較し、CD127+CD117+NKp44+ ILCsの割合が減少し、CD127+CD117- ILCsの割合が増加する同様の変化が認められた。現在、大腸正常粘膜部、癌部、UC炎症部粘膜・非炎症部粘膜より各分画を単離しFACSを用いて採取し、RNAを抽出して、RNAシークエンスによる遺伝子解析を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 炎症性腸疾患（IBD）関連癌の中でも、UC関連大腸癌に着目し解析を進めているが、頻度が少なく、十分なペースで標本を採取できていないため、解析がやや遅れている。通常型大腸癌症例を用いた正常大腸粘膜および癌部、IBD症例に関しては、症例数が蓄積されてきており、分画やサイトカイン産生の変化が明らかとなってきている。
Strategy for Future Research Activity	手術切除標本よりリンパ球を分離・採取し、FACSを用いて解析することで、ヒト正常大腸粘膜および癌間質、IBD腸管に存在するILC分画を確認できた。正常大腸粘膜には、特異的なILC分画が存在し、各分画間におけるサイトカイン産生の変化も確認できた。また、通常型大腸癌症例における正常大腸粘膜と大腸癌間質では、ILC分画の分布が大きく異なっていた。今後は、蓄積した症例におけるILC分画と臨床病理学的因子の関連を検討する予定である。 IL-22 pathwayに関しては、通常型大腸癌においては、IL22を高発現するCD127+CD117+NKp44+ ILCsが癌部で減少していることがわかった。今後、腫瘍深達度によるIL22産生能の変化を、FACSを用いた細胞内染色や、RT-PCRで評価する予定である。また、IBD関連癌症例に関しても、非癌部・癌部におけるILC分画やサイトカイン産生能を、通常型大腸癌の非癌部・癌部と比較し、評価していく。遺伝子発現に関しては、現在、通常型大腸癌症例の大腸粘膜部・癌部およびUC炎症・非炎症粘膜からILC分画を採取し、RNAシークエンスによる解析中である。症例を蓄積して、UC関連大腸癌の癌部に存在するILC分画についても解析の追加を検討中である。
Causes of Carryover	（理由）FACS抗体、細胞抽出用試薬、PCR関連試薬を購入し、今年度の実験に必要な物品を購入し終えたため。（使用計画）引き続き、上記同様FACSおよびPCRに必要な試薬の購入や、RNAシークエスの費用として使用する予定である。臨床検体を用いて免疫細胞を分離し解析することで、IBD関連癌に関連する因子を同定するため必要な物品である。