Elucidation of NASH pathogenesis by the cancer specific energy metabolic machinery regulatory gene

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10679
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 廣川 文鋭 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (20322373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高井 真司 大阪医科大学, 医学研究科, 教授 (80288703)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 非アルコール性脂肪性肝炎 / Warburg効果 / microRNA

Outline of Annual Research Achievements

近年、環境の欧米化に伴い脂肪肝の割合が増加している。さらにアルコールに依存せず肝硬変および肝細胞がん（Hepatocellular carcinoma : HCC）に進行する可能性をもつものを非アルコール性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis : NASH）という。またがん細胞は有酸素下においても嫌気性解糖系でATP産生をしており、これをがん特異的エネルギー代謝機構（Warburg効果）という。本研究ではNASH発症ラットモデルを用い、Warburg効果の関連遺伝子を中心にNASH及びNASH由来肝細胞がんの病態を解明することを目的としている。
ラット及びマウスの2種の動物モデル（SHRSP5/Dmcr,C57BL/6J-NASH）に高脂肪食を与えてNASHモデルを作成し適齢週で肝臓を摘出した。摘出した肝臓をWestern Blotting法及び免疫染色法にて解析したところ、Warburg効果の律速酵素であるPKM2およびリン酸化PKM2の発現上昇を認めた。さらにPKM2の発現上昇要因をmicroRNAの観点からreal time RT-PCR法にて解析を行ったところ、肝臓の約7割を構成しているといわれているMIR122の発現がNASH肝において優位に低下していることを確認した。さらにLuciferase reporter assay 解析をしたところ、MIR122が直接PKM2の3'-非翻訳領域（UTR）に結合し発現を抑制していることを確認した。以上より、NASH肝においてはMIR122が低下したことでPKM2発現抑制が解除され、PKM2発現が上昇したと考えられWarburg効果が活性化していることが示唆された。
またNASH肝をリン酸化プロテオミクス解析したところ、コントロール群と比較して回路全体の動態としてWarburg効果が活性化していることが証明された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

免疫染色において抗体濃度の調節に時間を要したが、染色液等を別種に変えるなどを工夫することにより問題は解決された。
動物モデル飼育に長期間を要するものの途中死亡などの大きな問題は認めなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後NASH肝においてPKM2を発現調整遺伝子であるPTBP1およびPTBP1関連microRNAの発現解析を行う。
NASH動物モデル（C57BL/6J-NASH）の発がん性を確認するため、長期飼育を実行中である。発がんを認めた際は、PKM2およびMIR122の発現量の比較を行う予定である。またプロテオミクス解析を施行し網羅的なタンパク質構造・機能の変化を比較検討する。
以上の実験よりNASH発症からHCC発生までの一連の病態を解明することが可能となる。さらにPKM2阻害剤を中心としたNASH及びHCC発症予防効果の検討をし、新規薬剤の探索を行う。

Causes of Carryover

自研究室において以前より所持していた抗体・試薬を使用したため次年度使用額が生じた。また本年度は、新たな抗体や動物モデルを購入する予定であ。