緑色蛍光タンパク質結合一本鎖人工抗体を用いた癌可視化システムの構築および臨床応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10685
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 林 洋毅 東北大学, 大学病院, 講師 (30422124)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80323103)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 緑色蛍光タンパク

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は，上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する人工一本鎖抗体(scFv)に緑色蛍光タンパク質(GFP)を結合させることで，癌の局在を可視化するというものである．これにより，術中に癌の切除範囲が十分かどうかを確認出来るという利点が考えられる．本年度はGFPと一本鎖抗体の結合を行い，そのタンパク機能を確認し，in vivoでの実験を行い，癌の可視化が可能かどうかを検討する予定である．
GFPと上皮増殖因子受容体一本鎖抗体(528-scFv)をそれぞれ大腸菌発現系を用いて作成を行い，それぞれの機能を確認した．すなわち，蛍光発色と528-scFvの上皮増殖因子受容体への結合を確認した．これら２つのタンパク質はいずれも機能していることが確認され，これらを結合することを開始した．それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子上で結合し，GFP-リンカー-528-scFvとなるような遺伝子配列を作成し，ベクターに導入し，タンパク質の発現を試みた．しかしながら，蛍光発色ならびにEGFRへの結合を確認することができず，タンパク質の立体構成により機能が損なわれているものと考えられた．現在タンパク質が十分に機能せず，その原因追求を行っている．
528-scFv自体に標識を行い，癌細胞を含む組織に作用させると，癌細胞に一致した結合を確認できたが，発光が弱く，特殊な暗室，UVライトなどを必要とするため，「手術室で癌を可視化する」という本来の目的は達成できないと考えた．
したがって，手術室で，携帯用のハンディライトを用いて発光が確認出来る必要があり，蛍光標識物質の最適化等について検討を行うこととした．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

タンパク質の蛍光発光ならびにEGFEへの結合能が低下しており，タンパク質の立体構成上の問題が推測された．この不具合を解消するため，リンカーの長さを変更し，機能回復に務めている．
タンパク質自体を蛍光標識する方法も模索したが，蛍光発色が弱く，暗室，紫外線ライトなどの特殊な環境での確認しかできず，手術室で外科医が癌を可視化するという本来の目的については達成出来ていない．
以上により，当初計画より進捗はやや遅れている状況である．

Strategy for Future Research Activity

この不具合を解消するため，リンカーの長さを含めタンパク質の構造を変更し，終了ならびに機能チェックを繰り返し，最適な構造を模索していく予定である．
GFP-scFvの機能回復が得られた後に，癌細胞株，癌細胞株の移植モデル，癌組織の異種移植モデルなどを用いて癌組織の可視化について実験を行っていく予定である．

Causes of Carryover

タンパク質の機能が確認できておらず，実験にやや遅れが出ており，当初予定の予算を下回る執行となっているため．