2017 Fiscal Year Research-status Report

移植可能なiPS細胞由来膵外分泌細胞の作成と膵液流出路を確保した移植方法の確立

Research Project

Project/Area Number	17K10688
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	阪本良弘東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (70343746)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松浦勝久東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (70433993)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	膵外分泌機能不全 / 膵外分泌細胞 / iPS細胞 / 再生医療
Outline of Annual Research Achievements	膵外分泌不全は、膵臓の消化酵素の欠乏に起因する病態である。その臨床徴候には脂肪便や栄養失調が含まれ、栄養失調関連合併症や心血管系疾患の罹患リスク上昇等に関連している。膵外分泌不全の現在の治療法は、食事療法や酵素補充療法であるが、これらの治療法を患者は永続的に続ける必要があり、治療効果も限定的である。別の治療法として細胞補充療法（ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導した分化細胞の移植）が望まれている。膵臓外分泌細胞の膵外分泌不全患者への移植では、移植細胞から分泌された消化酵素は消化管へ送達されて消化機能を発揮する必要がある。また、分泌物の送達経路の確保は、消化酵素による移植細胞や周辺組織の自己消化を防ぐためにも必要である。本研究では胃に発生する異所性膵からの着想で、胃壁中に膵外分泌細胞の移植を試みた。同種移植モデルとして、ラットの膵臓外分泌細胞を胃の粘膜下層中に移植を行なったが、移植細胞は自己消化されてしまった。粘膜下層直上の粘膜筋板が胃内腔への膵酵素分泌を妨げたと考えられた。消化管から固有粘膜層及び粘膜筋板を除去すると、固有粘膜層のみが再生することが知られている。粘膜筋板を除去するために、ラットの膵臓外分泌細胞を胃の粘膜下層中に移植した後、3日後に移植部位の固有粘膜層および粘膜筋板を電気メス焼灼した。その後、制酸薬投与にて固有粘膜層のみを再生させると、移植細胞から分泌された消化酵素が胃内腔へ機能的に送達され、移植組織の生着、および胃液中のアミラーゼ上昇を認めた。また、iPS細胞より膵外分泌細胞を誘導し、同様の方法でNude ratの胃粘膜下へ移植をしたところ、４例中２例で移植組織の生着および胃液中のアミラーゼ上昇を認めた。本研究は、移植細胞分泌物の消化管への送達を可能にする機能的移植方法を見出し、膵外分泌不全をはじめとする外分泌機能不全の再生療法に利用できると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、ラットの膵外分泌細胞を胃粘膜下層へ同種移植したのちに粘膜面焼灼によって粘膜筋板を除去することで、移植組織の生着および胃液中のアミラーゼ上昇を認めることを見出し、膵外分泌細胞の機能的に移植する方法を確立した。また、iPS細胞より膵外分泌細胞を誘導するプロトコールを確立し、同様の移植手法で胃液中のアミラーゼ上昇が確認された。しかしながら、iPS細胞より誘導した膵外分泌細胞の移植では、移植組織の生着および胃液中のアミラーゼ上昇を認めたのは４例中２例であった。iPS細胞からの膵外分泌細胞誘導プロトコールに関しては、成人膵臓とiPS細胞より誘導した膵外分泌細胞を比較すると、膵腺房細胞のマーカーであるPTF1A、アミラーゼ、トリプシンの発現が低く、十分に成熟した膵外分泌細胞が作成できないないと考えられた。実際に、作成した細胞を用いて膵酵素の分泌負荷試験を行なったが、膵酵素の有意な分泌を認めなかった。胃壁中に移植された細胞は移植後に粘膜下層の環境でさらに細胞の成熟が進んだと考えられるが、iPS細胞からの誘導の段階でより成熟した細胞を作成できれば、さらに高効率でiPS細胞より誘導した膵外分泌細胞を機能的に移植できる可能性がある。また、移植手法についても、電気メスで移植部位を焼灼する手法では、焼灼した際に移植した細胞を障害する可能性があり、別の手法で固有粘膜層および粘膜筋板を障害する手法も検討が必要である。今後、さらなるiPS細胞からの膵外分泌細胞誘導プロトコールの精錬、および移植方法の改善が望まれる。
Strategy for Future Research Activity	より高効率な移植のため、iPS細胞から膵外分泌細胞を誘導するプロトコールの改善、および移植手法の改良を行う。 iPS細胞から膵外分泌細胞誘導については、膵外分泌細胞誘導には細胞外基質およびそれに含まれるFGF7などの小分子が重要であることが報告されている。本研究のプロトコールではMatrigelなどの細胞外基質成分、および関連小分子を使用していないことから、今後はそれらの細胞誘導因子を用いたiPS細胞誘導を試みる。具体的に、作成された細胞を用いた膵酵素の分泌負荷試験により、膵酵素の分泌を確認できるような細胞の作成を目指す。移植手法については、電気メスで焼灼する以外にも、エタノール、酢酸、冷凍法などによる固有粘膜層および粘膜筋板を障害する手法も報告されており、それらの手法で移植後の生着細胞数や胃液中のアミアーゼ分泌量の変化などを比較する
Causes of Carryover	成果につき国際学会にて発表を予定していたが、研究計画が応募に間に合わず断念したため次年度使用額が生じた。2018年度はより高効率な膵外分泌細胞の移植のため、iPS細胞から膵外分泌細胞を誘導するプロトコールの改善、および移植手法の改良を行う。また、成果につき学会での発表、海外誌への論文投稿を行い、成果の報告に務める。