神経活動と末梢血流の多角的光学計測による血行障害への保存療法に対する実験的解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10764
• Research Institution: International University of Health and Welfare
• Principal Investigator: 地引 政利 国際医療福祉大学, 大学病院, 准教授 (50422481)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 勝重 駒沢女子大学, 人間健康学部, 教授 (80291342)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 閉塞性動脈硬化症 / 末梢血流 / 新生血管発達 / 側副血行路 / 神経性因子 / 光学イメージング法 / 膜電位感受性色素 / 運動療法

Outline of Annual Research Achievements

閉塞性動脈硬化症（PAD）に対する保存的治療である運動療法では、最大歩行距離が改善されることは実際に観察されている。その一方で、安静時ABI（下肢分節血圧比：下肢血圧/上腕動脈血圧）の改善が少ないことも、臨床上しばしば経験する。こうした運動療法による症状の改善の根拠となる側副血行路発達のメカニズムに関して、解剖学的あるいは生化学的に一部解明されている。しかし、末梢神経系と血管新生や側副血行路形成は、相互にどのように関連しその発達に関与しているか、解明されていない。
本研究では、「神経活動と末梢血流の多角的光学計測法」、すなわち、「細胞電位活動の光学的イメージング法」と「内因性光学イメージング法による血流評価法」を末梢経-骨格筋標本、あるいは末梢神経-血管標本に適用し、側副血行路発達と神経活動がどのように関与しているかを解析し、PAD 患者に効率的な保存的療法の再考を行うことを目的とする。
昨年度から本年度にかけて、これまでの結果に基づき、さらに研究目的に合ったモデル標本の確立を目指して実験・解析を行った。血管を制御する自律神経系のうち交感神経に焦点をあて、これまで良好な結果が得られなかった鶏胚から交感神経幹を摘出することを再度試みた。しかし、やはり、標本が小さく脆弱であることから十分な標本を得ることには至らなかった。一方、生後5-6週齢のラットの交感神経幹を標的とした標本では、比較的充分な長さの交感神経幹が得られ、さらに実験を進めることになった。標本を膜電位感受性色素NK2761によって染色を行ったところ、交感神経幹が十分に染色され、交感神経幹の電気刺激により交感神経節からシナプス電位を記録することに成功した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

分担研究者の研究室では、これまで胎生期の中枢神経系に膜電位の光学的イメージング法を適用し、中枢神経系の機能発生過程を追跡してきた。本研究でも、モデル標本確立のための第一歩とし、まず実験動物として取扱いが容易である鶏胚を選び、その交感神経幹を摘出することを試みた。しかし、鶏胚の交感神経幹は非常に小さく脆弱で光学測定に必要な標本を作製することは困難であった。そこで、実験対象を生後3-5週齢のラットにして、その交感神経幹の摘出を試みたが十分な結果は得られず、さらに体格の大きい生後5-6週齢のラットを用いて、十分な長さの交感神経幹を摘出することができた。摘出されたラットの交感神経幹は、結合組織にくるまれていたため、これをそのまま膜電位感受性色素で染色することはできなかった。そこで、摘出したラットの交感神経幹を、まず様々な濃度のコラゲナーゼを含む人工脳脊髄液で処理し、その最適濃度を見いだした。これにより、吸光膜電位感受性色素NK2761で、ラットの交感神経幹を染色することが可能となった。交感神経を電気刺激によって、交感神経幹を伝搬する活動電位や、交換神経節におけるシナプス後電位を安定して光学的に記録することができるようになった。これの再現性が得られるか検討中であった。現在のところ、まだ実験系の確立に終始しており、当初の計画が遅れることとなった。

Strategy for Future Research Activity

現在までの研究により、生後3-5週齢のラットの交感神経幹の摘出、コラゲナーゼ処理後の膜電位感受性色素による染色が可能となり、比較的安定した標本系が確立したところで、本年度も昨年度に引き続き以下の項目を中心に解析を進める。①最適膜電位感受性色素のスクリーニング:ラットの交感神経幹を様々な蛍光膜電位感受性色素で染色し、神経の電気刺激による活動電位の検出を行う。その結果として、シグナルの大きさや神経へのダメージを考慮しながら最適な膜電位感受性色素をスクリーニングする。②交感神経-血管標本の確立：初年度は、交感神経幹だけの摘出に成功したが、さらに交感神経の投射先である血管のついた「交感神経-血管標本」作成を試みる。③交感神経刺激により誘発される神経応答パターンの解析：交感神経-血管標本を膜電位感受性色素で染色し、交感神経を吸引電極で刺激することで血管に対する効果を検討する。さらに血流との関係の解析も行う。④交感神経節光学的に記録されたシナプス後電位の性質を評価する。各薬剤（d-tubocurarineなど）の存在下による計測を行うことで神経活動伝搬やシナプス伝達の評価を検討していく。
以上の①-④の実験を進めることにより、側副血行路発達と神経活動がどのように関与するかを解析するための基礎を確立する。

Causes of Carryover

実験対象の鶏胚交感神経幹は非常に小さく脆弱であり、光学測定に必要な標本を作製することは困難であった。そこで、十分な長さの交感神経幹を得るために実験対象を生後5-6週齢ラットとして実験を行っている。また、摘出標本を様々な濃度のコラゲナーゼを含む人工脳脊髄液で処理が必要となり、さらに筋内の神経確認標本作製に困難を極めている。以上から各々実験研究遂行のためラット、光学イメージ用の膜電位感受性色素・コラゲナーゼなどの試料、学会・研究会報告などの経費が必要となる予定でいる。