2017 Fiscal Year Research-status Report
Effect of insulin on platelet aggregation in coronary artery bypass grafting
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17K10771
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| Research Institution | Kyushu University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
山本 隆一 九州保健福祉大学, 薬学部, 教授 (10094111)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
蒲生 修治 九州保健福祉大学, 薬学部, 准教授 (20273930)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 血小板凝集 / 糖尿病 / 心バイパス手術 / スパズム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重症の冠動脈疾患には冠動脈バイパス手術が適用されるが、移植された血管は、血管内皮細胞が脱落しているため、血小板の活性化が生じやすい状態にある。活性化された血小板から放出されるセロトニン(5-HT)などのケミカルメディエータは、さらなる血小板の活性化を惹き起こすことによりバイパス血管のれん縮を生じさせるため、手術の成功率に大きな影響を与える。このバイパス血管のれん縮は、非糖尿病患者に比べて糖尿病患者で生じ易いことが知られている。したがって、インスリン作用不全が血管平滑筋のみならず血小板の反応性をも亢進することを証明できれば、糖尿病患者でバイパス手術後に血管閉塞が生じやすい原因の解明につながるとともに、より安全なバイパス手術の予後改善に寄与できる。我々は、ウサギから採取した全血を遠心分離によって血小板と他の血球成分とに分離し、さらに内因性インスリンの影響を除くために、洗浄用カルシウム不含バッファーにて血小板を洗浄した。その後、再度遠心分離によってバッファーを取り除き、適切な反応バッファーに血小板を再懸濁して実験に供した。血小板凝集測定装置を用いたセロトニンによる血小板凝集能は、インスリン未処置群で34～38％、インスリン300 nM処置群では26～31％でありインスリン処置群で凝集が抑制されている。しかし、測定の誤差が大きく実験の信頼性を高める必要がある。現在、安定した測定結果を得ることができるよう、より適切なインスリン処理条件の設定を再度検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
我々はこれまで、インスリンにはセロトニン2A （5-HT2A）受容体をヒト血管平滑筋細胞膜から細胞質に引き込むインターナリゼーション作用があることを報告してきた。この結果から、糖尿病患者の血管で見られるセロトニンに対する収縮反応性亢進は、インスリンの作用不全によって血管平滑筋細胞膜の5-HT2A受容体の数が相対的に増加したためではないかと考えている。
血小板膜にはセロトニン受容体が発現しており、自分自身や他の血小板から放出されたセロトニンにより活性化され迅速な血小板凝集を起こすことが知られている。平成29年度は、血小板膜においても、インスリンによるG蛋白質共役受容体のインターナリゼーションが惹起されるのかを明らかにする目的で、血小板凝集におけるインスリンの影響について以下の2点を目標として展開した。①より適切なインスリン処理条件の設定②インスリン処理による血小板膜上の5-HT2A受容体量の変化。現在のところ、適切なインスリン処理条件の設定ができていないが、血小板の生理活性を保つ条件設定はできてきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、血小板膜上の5-HT2A受容体蛋白を定量する実験手技は確立しており、血小板に作用させるより適切なインスリン処理条件が設定できれば研究の遅れは取り戻すことができ、平成30年度の目標であるインスリンによるG蛋白質共役受容体のインターナリゼーションの細胞内メカニズムを明らかにすることが可能と考えている。平成30年度には、インスリンの作用メカニズムの解明を目指し、以下の2つの方向からのアプローチを行う。①インスリンで刺激した時の細胞内分子の活性化に関する検討：細胞内シグナル分子の発現量、リン酸化レベルおよびトランスロケーションなどについて、主としてウエスタンブロット法やリアルタイムPCR法を用いた解析を行う。②細胞内シグナル分子の受容体インターナリゼーションにおける役割の解析：細胞内シグナル分子の阻害薬または刺激薬を作用させた血小板の反応を調べ、凝集能や受容体インターナリゼーションにおけるそれぞれのシグナル分子の関与を解明する。血小板は無核の細胞断片であるため、外界から刺激を受けても、遺伝子誘導や蛋白合成が行われることは無い。ゆえに、細胞外環境が血小板の反応性に影響を与えるとすれば、その変化はシグナル分子の局在や活性変化に依存するところが大きいと考えられる。
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| Causes of Carryover |
平成29年度は、血小板膜においても、インスリンによるG蛋白質共役受容体のインターナリゼーションが惹起されるのかを明らかにする目的で、血小板凝集におけるインスリンの影響について以下の2点を目標とした。① より適切なインスリン処理条件の設定 ② インスリン処理による血小板膜上の5-HT2A受容体量の変化。しかし、昨年度は ①適切なインスリン処理条件の設定に手間取っているため、②の実験が実施できず次年度使用額が生じている。現在、①の設定がほぼできた状況であり、本年度で予算を使用する予定である。
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