2018 Fiscal Year Research-status Report
血液凝固第九因子由来のペプチドによる外傷性脳損傷の治療
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17K10850
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
日だい 智明 日本大学, 医学部, 准教授 (70228732)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 外傷性脳挫傷 / 血液脳関門 / 血管透過性 / 凝固第９因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、血液凝固第九因子のactivation peptideを化学的に合成し(F9-AP)、脳挫傷(TBI)モデルラットへの治療効果を検討する。 Wister-Kyotoラットを用いて、Controlled Cortical Impact (CCI) 装置による脳挫傷モデルを作製し、一ヶ月間観察した。治療群では 300μg/kg のF9-AP を PBS に溶解し、尾静脈より連日投与した。コントロール群では 同量のPBS を投与した。Sham手術群、コントロール群、F9-AP 治療群に対して、行動学的評価、組織学的解析を行い、比較・検討した。 治療群のラットはコントロール群のラットに 対して、行動学的評価のうちの神経学的検査とプラス迷路試験で改善傾向を示した。また、平均台歩行試験では有意な改善をみせた。この改善は、観察期間 (1ヶ月)に渡って持続した。形態学的な観察では、CCIによる陥凹部のサイズが、F9-APにより約80%縮小し、神経細胞の数もcontrolに対して有意に多く残存していた。これらの改善は受傷1日後から有意であることから、F9-APの受傷直後の効果を解析した。受傷直後の脳では、血管透過性が亢進し、BBBの機能が障害され、それらが二次性脳損傷の原因の一つと考えられている。CCI翌日の脳浮腫とBlood Brain Barrierを評価したところ、脳の水分量増加は40％抑制されていたのに対し、エバンスブルーを用いて測定したアルブミンの漏出は70%以上も抑制されていた。これらの結果から、F9-APは脳血管のタンパクの通過に関わるトランスサイトーシスに影響している可能性が示唆された。トランスサイトーシスでは、細胞骨格であるチュブリンが必須の働きをしている。培養細胞を用いた実験により、F9-APが一時的にチュブリンの重合を強く抑制することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究予定は以下の通りであった。
１、H29 年度はF9-AP の投与により CCI の病巣は時間的・空間的にどのように変化するのか、組織学的、 生化学的に明らかにする。
２、H30 年度以降:二次的脳損傷の軽減に主要な働きをする遺伝子群を同定する。
１、の目標については、F9-APが受傷以後24時間でのBBBの機能を著名に改善し、その治療効果は急性期から顕著であることが判明した。そのため、研究の焦点を急性期に絞ることができるようになり、十分な成果を上げることができた。２、については、シャム群、コントロール群、治療群のラット脳よりRNAを抽出し、現在遺伝子発現様式の解析中であり、ほぼ順調に進んでいる。さらに、in vitroの実験から、F9-APが細胞骨格に影響することが示唆されたため、チュブリンに作用する薬が予想していなかった脳挫傷の治療薬として研究の標的になると期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子発現様式の結果から、脳挫傷治療のターゲットになりそうな軽症化遺伝子(なければ重症化遺伝子)があれば、その治療効果を In vivo の実験で確認する。軽症化遺伝子の cDNA を非ウイルスベクターを用いてラットに導 入する。重症化遺伝子の場合は siRNA を使用する。我々は非ウイルスベクターを使って脳への遺 伝子導入効率を上げる方法を開発しているのでそれを利用する。通常市販されている In vivo 用の遺伝子導入薬を経静脈的に使うと、主に肝と肺に導入遺伝子が発現する。しかし、我々の開 発した遺伝子導入増強剤を同時に使用すると、肝や肺と同程度の発現量が脳でも得られる。軽症 化遺伝子を脳に導入したラットに対して CCI 実験をおこない、軽症化の有無を確認する。
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| Causes of Carryover |
計画書通りにH30年度中にラット脳より抽出した発現RNA様式の解析を外注したが、その解析結果がでるのに３ヶ月以上かかるため、H31年4月現在で未だ結果が出ていない。そのため583200円の支払いが終わっていない。
さらに326786円の残金が生じる。これまでの実験により、当初予想していなかったF9-APのチュブリン脱重合作用が発見された。この現象の解析に費やす研究費は予算に計上していなかったので、培養血管内皮細胞を用いてチュブリンとF9-APの関係について検討するのに、残金を使用する。
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