アクアポリン１１の特性に基づいた脳浮腫治療法の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10851
• Research Institution: Meiji Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 田中 靖子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 脳梗塞 / 脳浮腫 / 中大脳動脈梗塞 / アクアポリン

Outline of Annual Research Achievements

アクアポリン（AQP）ファミリーのうち、AQP11欠損マウスの代表的な表現型は多発性嚢胞腎による腎不全により２～４週齢で死亡する。さらに、AQP11はマウスにおいて他の組織にも数多く発現しており、脳組織の血液脳関門の血管内皮細胞と脈絡叢上皮細胞に発現することをこれまでに報告している（Koike S. et al. 2016）。脳において発現するAQPに注目すると、AQP4が脳浮腫に重要な関わりがあることが報告されているが、AQP4の調節のみでは脳浮腫を治療することは不十分であることから、同じ部位に発現するAQP11も脳浮腫の制御に関与し、治療にも重要な役割を担っている可能性がある。AQP1も脈絡叢に発現していることが報告されているが、浮腫の原因の中心的な原因遺伝子である報告はない。
これまでに代表者は「左頸動脈を結紮させた脳梗塞モデルマウスは、未施術に比べてAQP11の発現量が1/2に低下し、脳梗塞にAQP11が関与する」ことを簡易的な条件下での予備実験で示した。そこで本研究では、中大脳動脈梗塞術モデルマウスを作成し、AQP11が脳梗塞後の脳でどのような役割を担っているのかを解明するのが目的である。さらには、AQP11欠損マウスに脳梗塞モデルを作成することにより、血液脳関門でのAQP11の脳浮腫や脳脊髄液代謝の制御への関与を解明して、脳梗塞、脳出血、脳浮腫の新たな治療戦略を提案できるようにする。また、AQP11は脳や腎臓以外の組織にも発現していることから、脳梗塞後の他組織への影響も検討することにより、AQP11の未知なる役割を明らかにする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、左総頸動脈を結紮させた脳梗塞モデルマウスを用いた予備実験では、ある程度有意差のある結果を得られてはいたが、代表者の研究環境では簡易的な条件でしか施術を行うことができないことに懸念があった。（愛護的に行うことはできていたが、ネンブタールの麻酔下で急いで結紮およびその後の血流再開を行っていたこと。体温調節を行う環境がなかったこと。モデルマウス作成後に全脳よりRNAを抽出して発現量を調べていたため、虚血部位が存在していたか否か確認をしていなかったことなど。）
そこで、本研究で中大脳動脈梗塞術作成のために準備した装置において、追実験を行いながら中大脳動脈梗塞術モデル確立に向けてスタートした。中大脳動脈梗塞術モデルマウスの作成は代表者にとって初めての試みであったことから、まずは手技の確立が重要であった。この手技を習得するにあたり、熊本大学医学部へ赴きご教授いただいた。手技の習得に関しては、複数回練習をすることでモデルマウスの確立はできると確信した。
予定外であったことは、現報告時において研究環境は整ってきたが、交付開始時、代表者は留学中であったことから、研究開始が予定より遅れた。本研究のための装置などを揃えることも予定より遅くなってしまった。さらに、留学中および帰国後にAQP11欠損マウスの飼育が上手くいかず、マウスの継続的な飼育がやや困難になりかけたことも研究開始が遅れた理由である。現在は装置もマウスの飼育環境も整ってきており、安定した環境により追実験およびMCAO確立の条件を検討しているところである。開始は遅れたが、今後の研究は予定通り行うことができる。

Strategy for Future Research Activity

手法に関わらず脳梗塞モデルマウス用いる場合は週齢だけでなく体重を揃えて比較を行う必要がある。マウスを継続的に使用することは可能となり、マウスの準備に大きな問題はないが、AQP11欠損マウス（ホモ）は生まれる確率が少なく、成長が遅いので小さいことから、まずは野生型を用いて結果を揃え、確立させていく。まず、総頸動脈結紮モデルの追実験をさらに検討し、結紮時間および再灌流後の経過時間を変化させたモデルを用いる。これと並行して、中大脳動脈梗塞モデルマウス作成もさらに確立させる（結紮時間および再灌流後の経過時間の検討も含める）。これらは、AQP11を中心に他のAQPの発現変化をこれまで行ったRNAの発現変化だけでなく、タンパクの発現変化もウエスタンブロットや免疫染色で未施術マウスと比較し、結紮モデルあるいは中大脳動脈梗塞モデルマウスと比較検討を行う。さらに、マトリックススライサーを用いて連続切片を作成し、TCC（トリフェニルテトラゾリウムクロライド）染色による虚血の程度、脳全体の左右差のサイズバランス、神経細胞およびアストロサイトも各因子を用いて遺伝子変化および形態変化も比較検討する。成体マウスは身体の成長が完成しているので丈夫であり比較的モデルマウスを作成しやすいが、AQP11欠損マウスは身体のサイズが小さいのがやや困難をきたしそうだと予想される。よって、約２～４週齢のAQP11欠損マウス、AQP11欠損マウスと週齢を合わせた野生型マウス、これらと体重が同程度の１～３週齢の野生型マウスの総頸動脈結紮あるいは中大脳動脈梗塞モデルを用いて、梗塞後の脳の変化を慎重に検討する必要がある。

Causes of Carryover

研究開始が遅れた事などによる試薬未購入。引き続き継続することは可能なため、昨年度に購入しなかった試薬を購入する。