2018 Fiscal Year Research-status Report
HSVtk遺伝子導入Muse細胞を用いた膠芽腫治療戦略と生体モニタリングの開発
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17K10861
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
山崎 友裕 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (40781050)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
難波 宏樹 浜松医科大学, 医学部, 教授 (60198405)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 自殺遺伝子幹細胞療法 / HSVtk遺伝子 / PET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在まで当研究室では、単純ヘルペスチミジンキナーゼ(HSVtk)遺伝子導入Muse細胞(Muse-tk細胞)を用いた自殺遺伝子幹細胞療法に関するin vitroバイスタンダー効果、遊走能、in vivoバイスタンダー効果、遊走能、またMuse-tk細胞を脳内移植後100日間腫瘍形成が無いことを示した安全性確認実験を行い、現在臨床応用に向けた追加実験とGMP基準に準じた細胞製剤化を指向した企業連携を進めている。臨床応用を視野に入れた場合、移植後のtk幹細胞の腫瘍内分布をモニターすることはGCVの投与期間を決める上で重要な情報である。そこでPETを用いたtk幹細胞の生体モニタリングの開発のためPET分子プローブとして9-(4-[18F]fluoro-3-hydroxy methylbutyl)guanine(18F-FHBG)を作成し、予備実験としてヌードマウス脳内にHSVtk遺伝子導入U87ヒトグリオーマ細胞を当該細胞数移植し小動物用PETにてイメージングを実施したところ検出に至らなかった。原因として、マウスに移植したtk幹細胞数がPETの検出感度に達しなかった可能性があり、移植細胞数を増やすべく、使用する実験動物をラットに変更し実験を進める計画とした。ラットに変更した場合、使用するHSVtk導入幹細胞数が非常に多くなる。供給可能なMuse-tk細胞数限りがあるため、他の手法でのHSVtk遺伝子導入幹細胞の作成法を考案し新たに考案した本tk発現幹細胞について特許を申請すべく新たに追加でin vitroの実験を行うとともに、PETでの検出実験に向けたデータの蓄積を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
作成した18F-FHBG分子プローブのHSVtk反応性については問題なきことを確認している。予備実験で使用したHSVtk遺伝子導入U87ヒトグリオーマ細胞については ガンシクロビル(GCV)反応性が良好であり、予備実験で使用した材料に関しては問題ないことを確認できている。HSVtk遺伝子発現細胞の移植数を最大限まで増やしてみたが、マウス脳に移植できる細胞数には限りがあり、マウス脳内に移植できるHSVtk遺伝子発現細胞数ではPETの検出感度に達しないことが考えられ、実験動物としてラットを用いるべく計画を変更した。一方、Muse細胞の提供に限りがあることから他の手法でのHSVtk遺伝子導入幹細胞の作成法を考案し、追加でin vitroの実験を行うとともに、PETでの検出実験に向けたデータの蓄積を行っている。本理由の為進捗状況としては当初の計画と比べてやや遅れているが、ここまで得られたデータは重要な知見であり、本研究を完遂すべく、引き続き検証を続けて行く所存である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、HSVtk遺伝子発現細胞のPETによる検出を実現すべく、実験動物としてラットを用いるための予備実験とPET実験に向けたPET分子プローブの作成準備を進める。ここまでの実験は過去の報告を踏襲した内容であり、実現可能性は高いと考える。また当初の計画通り、２年目以降に実施する計画であった実験を並行して進める。最終年度は患者由来悪性グリオーマ細胞株に対するin vitro、in vivoバイスタンダー効果並びに遊走能の検証を行い、実験の再現性の確認と共に、実臨床反応を反映した結果を得る計画となっている。つまり、実際に手術で採取した腫瘍組織から樹立した患者由来の悪性グリオーマ細胞株に対するバイスタンダー効果の検証を行い、また GCV投与のタイミング、投与量、投与期間を変えることにより効果の差異を検討していく。さらに、正常脳に対する本治療の毒性の検証をアポトーシスに着目 し、in vitro・in vivo real-time画像解析と組織学的検討を行う。HSVtk/GCVシステムはDNAポリメラーゼ阻害によるアポトーシスによる殺細胞効果を用いた治 療法であり、原理的には分裂細胞のみにアポトーシスが起こるが正常組織への影響については詳細な検討はされていない。そこでtk幹細胞と市販 の神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞を共培養し、ホスファチジルセリンに強い結合親和性をもつアネキシンA-5を蛍光色素標識した試薬を用いて、タイムラ プスイメージングにて細胞レベルのアポトーシスの検出を行う。またin vivoの毒性の検証のため蛍光色素標識したMuse-tk細胞を脳内移植し、GCV投与中のアポトーシスをアネキシンA-5投与後に二光子励起顕微鏡でリアルタイムに細胞レベルでの観察を行う。患者由来グリオーマ細胞株はすでに複数入手済みであり、当施設の倫理委員会の承認を待ち実験に移行する。
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