2018 Fiscal Year Research-status Report
髄液由来腫瘍核酸解析による中枢神経系悪性リンパ腫に対する非侵襲的新規診断法の開発
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17K10873
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
塩川 芳昭 杏林大学, 医学部, 教授 (20245450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市村 幸一 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (40231146)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中枢神経系悪性リンパ腫 / MYD88 / CD79B / Cell free DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中枢神経系悪性リンパ腫(Primary Central Nervous System Lymphoma; PCNSL)に特徴的な遺伝子変異のうち、MYD88 L265P変異 (76-85%)、CD79B変異 (83%) は特に高頻度であり、これらはいずれもNF-κBの恒常的活性化をもたらすPCNSLにおけるドライバー遺伝子変異である。PCNSLではこれらMYD88, CD79B変異のいずれかを有する症例は92%に及び、更にこれらの遺伝子変異は他の頭蓋内腫瘍性病変では極めて稀であるため、これらの遺伝子変異を髄液cell free DNAから検出する事はPCNSL診断の一助となり、特に画像上鑑別が問題となる神経膠芽腫との鑑別をはじめとしてその臨床的意義は大きく、髄液cell free DNAを用いた特にMYD88, CD79B変異を標的とする変異解析によるPCNSL診断のための非侵襲的検査開発を目標として研究を開始した。
2018年度は2017年度に収集を開始した髄液サンプルに加え、髄液が得られたサンプルでの腫瘍由来ならびに血液DNAの収集を行った。また、2017年度に作成したMYD88, CD79Bを含むPCNSLに高頻度な遺伝子変異の網羅的解析を目的とした変異解析パネルの条件検討を進め、更にdigital PCRでのMYD88 L265P変異検出の条件検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
杏林大学脳神経外科にて生検術を行ったPCNSLおよびPCNSL疑い症例において、2017年度から開始した髄液サンプルの収集に加え、髄液が得られたサンプルでの腫瘍由来ならびに血液DNAの収集を行った。
2017年に設計した、我々の先行研究での本邦におけるPCNSL症例の網羅的解析の報告(Fukumura K, Acta Neuropathol 131:865-875,2016; Nakamura T, Neuropathol Appl Neurobiol 42(3):279-290, 2016)で特に高頻度に認められた変異、びまん性大細胞性B細胞リンパ腫(Diffuse Large B cell lymphoma, DLBCL) における近年の網羅的解析の報告(Reddy, Cell 171(2):481-494,2017)において予後との関連が認められ臨床的に重要と考えられた遺伝子変異を含めたPCNSL遺伝子パネルにつき、複数のリンパ腫細胞株由来DNA、ならびに PCNSL臨床検体および同一症例の末梢血由来DNAを用いてIon torrent multiplex PCR法 (ThermoFisher) による変異解析の条件検討を行い、本研究で特に重視するMYD88, CD79B変異をはじめとして、変異検出が問題なく可能である事を確認した。
また、併せて髄液からのdigital PCRによるMYD88 L265P変異検出の条件検討をMYD88 L265P変異陽性の細胞株DNAを用いて行い解析の準備を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
杏林大学脳神経外科にて生検術を行ったPCNSL、ならびにPCNSL疑い症例において採取した髄液からcell free DNA抽出を行う。抽出したcell free DNAから、既に条件検討を行ったMYD88 L265P変異検出のためのdigital PCRを施行し、同一症例の腫瘍検体でpyrosequence法を用いたMYD88 L265P変異解析、または腫瘍DNAならびに末梢血DNAを用いた上記の変異解析パネルを用いたmultiplex PCR法による変異解析を行い、MYD88 L265P変異を解析し、髄液と腫瘍で結果が一致するか、比較検討する。更に、髄液から一定のcell free DNA量が得られた症例では、digital PCRによるMYD88 L265P変異解析に加え、髄液cell free DNAを用いて上記の遺伝子パネルを用いたmultiplex PCR法による網羅的変異解析を行い、腫瘍由来DNAの解析結果と比較することで、どのような遺伝子変異が髄液cell free DNAからmultiplex PCR法で検出可能であるか、探索的に検討する。
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| Causes of Carryover |
初年度（2017年度）では、本研究の対象となる中枢神経系悪性リンパ腫（PCNSL）の患者、更には、その比較対象となる代表的悪性脳腫瘍である神経膠腫患者において、研究材料である髄液検体の採取を摘出術の際に得られる腫瘍本体の検体と主に収集することを先ず第一義に行った。また、髄液検体や血液の検体からのPCNSLで特異的に認められる遺伝子変異であるMYD88遺伝子やCD79b遺伝子などを含むPCNSLに特化した新規遺伝子解析パネルの作成のために時間を労した。
2018年度は、これらのパネル検査を用いて、リンパ腫細胞株や、その他の脳腫瘍標本を使用してのpilot解析を行うとともに、liquid biopsyに有利なdigital PCR法やBNA clamp法の導入、条件設定の基礎実験を行った。培養細胞を観察するための倒立顕微鏡の導入（更新）も行った。そのため、年度内の使用額はほぼ予定通りとなった。最終年度の2019年度は、これまでに収集した、また新たに収集する新規患者検体を用いて、これら各種解析方法を実働し、研究結果をまとめていく予定である。未使用額については、これらの解析費用として使用する。
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