2019 Fiscal Year Research-status Report
髄液由来腫瘍核酸解析による中枢神経系悪性リンパ腫に対する非侵襲的新規診断法の開発
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17K10873
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
塩川 芳昭 杏林大学, 医学部, 教授 (20245450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市村 幸一 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (40231146)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 中枢神経系悪性リンパ腫 / MYD88 / CD79B / cell free DNA / cellular DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中枢神経系悪性リンパ腫(Primary Central Nervous System Lymphoma; PCNSL)に特徴的な遺伝子変異のうち、MYD88 L265P変異 (76-85%)、CD79B変異 (83%) は特に高頻度であり、これらはいずれもNF-κBの恒常的活性化をもたらすPCNSLにおけるドライバー遺伝子変異である。これらの遺伝子変異を髄液cell free DNA (cfDNA) から検出する事はPCNSL診断の一助となり、髄液cell free DNAを用いた非侵襲的検査開発を目標として研究を開始した。2018年度は2017年度に収集を開始した髄液サンプルに加え、髄液が得られたサンプルでの腫瘍由来ならびに血液DNAの収集を行った。また、2017年度に作成したMYD88, CD79Bを含むPCNSLに高頻度な遺伝子変異の網羅的解析を目的とした変異解析パネルの条件検討を進め、更にdigital PCR法によるMYD88 L265P変異検出の条件検討を行った。2019年度は、これまでに収集した髄液よりDNAを抽出し、抽出総量とそれに影響する臨床因子の検索、digital PCRを用いたMYD88 L265P変異検出の条件検討および検査精度の検証を行った。髄液を遠心分離して沈殿分画よりcellular DNA、上清よりcfDNAを抽出したところ、両者の抽出量は統計学的には同等であった。また、cellular DNAとcfDNAとでそれぞれにdigital PCRによるMYD88 L265P変異検出を試みたところ、変異陽性シグナル検出(Target/Total値)のカットオフ値を0.25%に定めたとき、cellular DNAでは感度 92.9%、特異度 100%、cfDNAでは感度、特異度ともに100%と、両者ともに非常に高い検査精度が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、収集された髄液よりDNAを抽出し、抽出総量とそれに影響する臨床因子(性別、年齢、髄液細胞診のクラス分類、臨床病気分類など) の検索、digital PCRを用いたMYD88 L265P変異検出の条件検討および検査精度の検証を行った。保存髄液を遠心分離し、沈殿した細胞分画よりcellular DNA、上清よりcfDNAを抽出した。それぞれの抽出量に統計学的に有意な差はみられず(p=0.87)、髄液から抽出されるDNA総量に影響する臨床因子は指摘されなかった。
また、髄液より抽出されたDNAを用いて、digital PCRによるMYD88 L265P変異検出の検査判定の条件検討および検査精度の評価を行った。MYD88 L265P変異陽性の腫瘍DNAと非CNSL患者の血液DNAを混合した段階希釈実験では、各希釈濃度とTarget/Total値に非常に強い線形相関がみられ(R2=0.999)、digital PCRはMYD88 L265P変異を定性的かつ定量的に判定できる検査法であることを確認した。
この条件で、cellular DNA、cfDNAを対象にdigital PCRでMYD88 L265P変異の判定を行ったところ、cellular DNAでは感度 92.2%、特異度 100%、ROC曲線のArea Under the Curve (AUC)は0.95、cfDNAでは感度、特異度ともに100%、AUC 1.00と、いずれの分画より抽出したDNAを用いた場合でも極めて高い検査精度を達成した。
以上のように、実験系は順調に調整されており、標本を使用した解析が進みつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
髄液より抽出した余剰DNAを用いて、野生型遺伝子の増幅を抑える手法であるBNP Clamp法を用いてCD79B変異の検出を試みる予定である。すでに前年度にBNP Clamp法の開発企業とprobe作成について協議を開始しており、今年度よりBNP Clamp probeの作成に着手する。さらに、変異解析パネルを用いたmultiplex PCR法による網羅的変異解析を行い、腫瘍由来DNAの解析結果と比較することで、どのような遺伝子変異が髄液より抽出したDNAから検出可能であるか探索的に検討する。
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| Causes of Carryover |
初年度（2017年度）では、本研究の対象となる中枢神経系悪性リンパ腫（PCNSL）の患者、更には、その比較対象となる代表的悪性脳腫瘍である神経膠腫患者において、研究材料である髄液検体の採取を摘出術の際に得られる腫瘍本体の検体と主に収集することを先ず第一に行った。また、髄液検体や血液の検体からのPCNSLで特異的に認められる遺伝子変異であるMYD88遺伝子やCD79B遺伝子などを含むPCNSLに特化した新規遺伝子解析パネルの作成のために時間を労した。
2019年度は、収集髄液からさらに効率よくcfDNAを採取すべく自動核酸生成装置(Maxwell RSC Instrument)を導入した。また、今後に余剰DNAを使用してBNP clamp法や変異解析パネルを用いたmultiplex PCR法による網羅的変異解析を行うために、cfDNAの長期保存用のDNA LoBind Tubeを購入・使用した。
BNP clamp probeの作成に時間を要していることと、検査の有用性の検証に十分量の髄液収集数を収集すべく、研究期間を一年延長し、検体数の増加と複数のリンパ腫特異的遺伝子変異検出法の検索を行っている。
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[Journal Article] Consecutive single-institution case series of primary central nervous system lymphoma treated by R-MPV or high-dose methotrexate monotherapy2020
Author(s)
Sasaki N, Kobayashi K, Saito K, Shimizu S, Suzuki K, Lee J, Yamagishi Y, Shibahara J, Takayama N, Shiokawa Y, Nagane M
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Journal Title
Jpn J Clin Oncol
Volume: inpress
Pages: 1-11
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Multiagent immunochemotherapy, R-MPV-A, for patients with secondary central nervous system lymphoma2019
Author(s)
Nagane M, Kobayashi K, Saito K, Shimada D, Matsumoto Y, Iijima S, Sasaki N, Yamagishi Y, Takayama N, Shiokawa Y
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Journal Title
Neuro-Oncology Advances
Volume: 1
Pages: ii32
DOI
Peer Reviewed
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