2017 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of CDC5L as a candidate causal gene for ossification of the posterior lingitudinal ligamant of the spine
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17K10933
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
冨永 博之 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (20750798)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 真吾 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60353463)
河村 一郎 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員准教授 (90535832)
小宮 節郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (30178371) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 後縦靭帯骨化症 / GWAS / CDC5L |
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| Outline of Annual Research Achievements |
後縦靱帯骨化症(OPLL)の原因候補遺伝子CDC5Lの発現プロファイリングを行なった。すなわち、OPLL組織サンプルを増やして免疫組織化学染色を継続した。その結果、OPLL骨化巣の間にある間質の細胞、軟骨様変性した後縦靭帯細胞に強い発現を認めた。対照的に、OPLL骨化内の骨細胞には発現を認めなかった。また変性していない後縦靭帯にも発現はなかった。この結果から、CDC5Lは未分化間質細胞と軟骨様細胞においてOPLL形成または維持、あるいは抑制など何らかの形でOPLLに関わっていると予想した。
CDC5Lのloss-of-functionの細胞分化への影響
上記のin vivoデータからin vitroの細胞分化系へのCdc5lの機能を検討した。マウス間質細胞株ST-2のBMP-2+アスコルビン酸+βグリセロリン酸の骨芽細胞分化誘導系でCdc5l siRNAによるノックダウンをしてみると、ALP染色や分化マーカー(Sp7, Ibsp, Ocn)の定量的RT-PCRで観る限り、著明な骨芽細胞分化亢進を呈した。一方、マウス軟骨細胞株ATDC5のBMP-2+ITSサプリメントの軟骨細胞分化誘導系にsiCdc5lを作用させると、alcian blue染色、分化マーカー(Sox9, Col2a1, Col10a1)の定量的RT-PCRの両者は著明に抑制された。この結果から、CDC5Lは間葉系未分化細胞の分化を骨芽細胞を抑制し軟骨細胞にシフトさせるはたらきがある可能性、あるいは、OPLL形成初期の靭帯軟骨様変性には促進的に働くが、骨芽細胞による骨化は抑制する2面性を有する可能性が考えられた。
CDC5L強制発現系の構築
すでにCDC5L発現プラスミドは構築済みであり、レンチウイルス発現プラスミドも入手し、これと293T細胞を用いてCDC5L発現レンチウイルスを作製した。これを元に強制発現系による細胞分化への影響を検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りに、発現プロファイリング、in vitro機能解析、強制発現系構築を進める事が出来ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
CDC5Lの”骨化”への作用点の検索(gain/loss-of-function実験)
細胞培養系に対し、作成したCDC5Lウイルスにて過剰発現させ、分化度への影響をqRT-PCRとウエスタン・ブロット、基質染色(ALP染色、アルシアン・ブルー染色など)で評価する。In vivo実験の代替として、マウスの採取可能な膝靭帯や、軟骨(胎子中足骨)、または骨(胎子頭蓋冠)のex vivo器官培養系へのCDC5LウイルスやshRNAレンチウイルス導入により骨形成や軟骨形成に対する影響を評価する。マクロ的にはALP染色、von Kossa染色、アルシアン・ブルー／アリザリン染色などで評価、マーカー発現解析は上記に準じる。
CDC5Lの作用メカニズム：標的分子の検索(RNA直接シーケンスと標的遺伝子の機能解析)
上記細胞培養系、特に前駆骨髄ストローマ細胞ST-2に対して、siRNAによるCcdc5lノックダウンを行い、mRNAを抽出してRNA直接シークエンス解析に供する。CDC5Lの機能として、予備実験の結果から骨芽細胞分化に対して抑制的な蛋白の遺伝子mRNAのスプライシングに重要な働きをしていると仮定している。したがって、このRNA直接シークエンス解析によって、コントロールsiRNAサンプルに比べてCdc5l siRNAで、i) 発現量が減るmRNA、ii)イントロン脱落不全のあるmRNA(異常なmRNA)が抽出目的遺伝子である。
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| Causes of Carryover |
OPLL臨床サンプルの新規採取が予想より少なかったために、免疫組織化学染色の数も少なかった為であるが、次年度以降に施行予定である。
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Research Products
(1 results)
