制御可能なiPS細胞注射による低侵襲脊椎固定術の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10935
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 鈴木 亨暢 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00445016)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺井 秀富 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20382046) ; 中村 博亮 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (60227931)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: iPS細胞 / BMP / HSV-TK遺伝子 / 低侵襲脊椎固定術

Outline of Annual Research Achievements

当研究は、骨形成タンパク-2 (Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)、及び、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ（HSV-TK）発現プラスミドベクターを導入したiPS細胞を作製し、同細胞の骨形成能、及び、ガンシクロビルの添加により発現ベクター導入細胞の細胞死を確認した後に、ラットを用いて細胞注射による脊椎固定術の検証を行うことを主目的とした研究である。
まずBMP-2遺伝子とHSV-TK遺伝子をIRESでつないだプラスミドを作製、GFP遺伝子を持つベクターにクローニングしプラスミドベクターを作製した。作製したプラスミドベクターの機能評価を目的に、マウス横紋筋由来細胞（C2C12細胞）にLipofection法にてベクターをトランスフェクションした後に、GFP陽性細胞を評価し導入率評価、BMP-2機能評価としてALP活性評価、HSV-TK評価としてガンシクロビル（GCV）との共培養による細胞数評価を行った。導入効率は80％前後と高水準でありGCV共培養による細胞死も確認された。しかし、ALP活性評価では実験により増加の幅に差があり再現性が低く、安定して骨芽細胞への分化ができていなかった。そこで、ELISA法及びWestern blotting法にてBMP-2蛋白の発現量に関する評価を行ったところ、BMP-2の発現は確認されたが、その発現量が不十分であることが判明した。この問題を解決するためには遺伝子導入効率を上げてる必要があると判断し、ウイルスベクターを用いる方針へと変更し、レンチウイルスベクターの作製に取り掛かった。ベクターDNAは、前述のプラスミドベクターのデザインを概ね引継ぎ、これにセレクション用の抗生剤であるブラストサイジン耐性遺伝子を組み込んだものとした。現在、このレンチウイルスベクターの作製を行っているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

前述の通り、当研究は最終的に臨床応用を目指している。そのため、ヒトへの使用にはハードルの高いウイルスベクターを極力用いずに、プラスミドベクターを用いて化学的にトランスフェクションさせる方法の確立に多くの時間を費やした。しかし、やはりプラスミドベクターではBMP-2の発現量が少なく、C2C12を骨系統細胞へと分化誘導するにはウイルスベクターを用いるしかないと判断した。現在レンチウイルスベクターの作製を行っており、ウイルスベクターによってこの問題が解決されれば、本研究は大きく進展すると考える。

Strategy for Future Research Activity

現在、ベクターDNAを作製中である。ベクターDNAの完成後は、ウイルス粒子作製用ベクターとともにウイルス産生用細胞にトランスフェクションし、レンチウイルスベクターを作製する。作製したレンチウイルスベクターをC2C12細胞に導入し、BMP-2の産生が認められるかをWestern blotにて検証し、骨芽細胞への分化はALP活性にて評価する。また、GCVとの共培養にて細胞死を確認する。確認されれば、in vivoでの評価としてC2C12細胞に作製したウイルスベクターを導入し胸腺ラットの横突起間に細胞を注射し、4週間、8週間の時点で犠牲死させ単純X線にて骨新生の状態を確認する。さらに注射部分の脊椎を摘出しmicro CTを用いて新生骨の骨質評価を行う。その後組織標本を作製し、組織学的に新生骨を確認した上で注入細胞生存の有無や骨新生への寄与の割合などを検討し、白兎の棘突起間に注射を行い、骨形成促進作用と骨癒合の評価、及び、GCV投与による骨形成促進作用の中断をμCTにて評価する。また、in vivoの実験に平行して遺伝子導入に適したiPS細胞の状態を探索する。iPS細胞から胚様体を作製しレチノイン酸の存在下で培養することにより、間葉系細胞へ分化を方向付けた後に、骨芽細胞分化培地で培養する予定であるが、どの時点での遺伝子導入を行うことが最も効率的に骨新生を生じるかを検討する。

Causes of Carryover

(理由)本年度は実験消耗品など計画通りに助成金を使用していたが、購入物品の価格の関係上次年度使用額として残存した。
(使用計画)前述の計画通りに細胞培養費の一部として使用する予定である。