Development of minimum invasive spinal fusion using controllable iPS cell injection

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K10935
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 鈴木 亨暢 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (00445016)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺井 秀富 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20382046) ; 中村 博亮 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (60227931)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ヒト人工多能性幹細胞 / BMP遺伝子 / 骨形成タンパク / HSV-TK遺伝子 / 単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ / 低侵襲脊椎固定術

Outline of Annual Research Achievements

当研究は、骨形成タンパク2 (Bone Morphogenetic Protein 2; BMP2)、及び、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ（HSV-TK）発現プラスミドベクターを導入したiPS細胞を作製し、同細胞の骨形成能、及び、ガンシクロビル（GCV）の添加により発現ベクター導入細胞の細胞死を確認した後に、ラットを用いて細胞注射による脊椎固定術の検証を行うことを主目的とする研究である。
ベクターデザインはBMP2遺伝子とHSV-TK遺伝子をIRESでつなぐデザインとし、プラスミドベクターを作製した。実験手法を確立するため、まずはiPS細胞ではなく、マウス横紋筋由来細胞であるC2C12とマウス頭蓋冠由来細胞株であるMC3T3-E1を用いることとした。GCV共培養では遺伝子導入細胞の細胞死を確認でき、HSV-TKの発現およびその活性は確認された。しかし、BMP2の発現は確認できず、ベクターの遺伝子配列を再確認したところ、BMP-2の配列に修正が必要な箇所があることが判明したため、ベクターを再作製した。再作製後のベクターを用いた実験では、HSV-TKは同様に機能しており、BMP2に関してもPCR法にて遺伝子発現を確認でき、ALP活性の上昇も見られた。
今後はin vivoでの評価として遺伝子導入細胞を無胸腺ラットの横突起間に注射し、4週間、8週間の時点で犠牲死させ単純X線、micro CTにて骨新生の状態を確認する。さらに注射部分の脊椎を摘出し組織学的な評価を行う。新生骨量が不十分であれば、レンチウイルスベクターへと変更する。また、GCV投与により骨新生が制御できるかどうかを検討する。in vivoの実験で意図した結果が得られれば、iPS細胞での実験を行う予定である。