Artificial nerves containing allogenic basal lamellae scaffold and bone marrow derived stem cells

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K10951
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 柿木 良介 近畿大学, 医学部, 教授 (20314198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤木 將男 近畿大学, 医学部, 教授 (00273441)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 人工神経鞘 / 血管茎 / 骨髄間葉系幹細胞 / 同種神経基底膜

Outline of Annual Research Achievements

これまでに我々は、骨髄間葉系幹細胞移植した同種神経基底膜と血管茎を含有したシリコンチューブで、ラット坐骨神経に作成した20mm欠損モデルを架橋したところ、移植24週での神経再生は、ほぼ自家神経移植に匹敵することがわかった(Y. Kaizawa et al. Cell Transplant 2017)。
臨床応用をめざして、本実験では、シリコンチューブを、東洋紡社製のNerbridge(R)の外筒管に変更し、かつfreeze and thawによって作成していた同種神経基底膜を、化学処理して脱細胞化(Ota T et al. Ann Thorac Surg 2007)したものに変更した。
電子顕微鏡的検索により化学処理して作成した同種神経基底膜では、ほぼ完全に細胞成分の遺残はなかった。Lewis ratの坐骨神経に作成された5mmの神経欠損を、Nerbridge外筒管内に腓腹動静脈茎を挿入した神経誘導管で架橋した群とNerbridge外筒管に腓腹動静脈茎を外付けして架橋した群とで、移植後12週で神経再生は、組織学的、電気生理学的に有為差はなく、anti-rat endothelial cell cytoplasmic antigen (RECA-1) antibodyを用いた染色でも、Nerbridge外筒管は、外付け血管茎から毛細血管を良く誘導していることがわかった。
Lewis ratの坐骨神経に作成された20mm神経欠損を、lewis rat由来の骨髄間葉系幹細胞を移植したDAラット由来の同種神経基底膜を含有させたNerbridge外筒管に血管茎を外付けした神経誘導管で架橋した群(C群)と20mmの神経片を再度縫合した自家神経移植群(A群)をそれぞれ20頭作成し、その神経再生を、術後12週、24週に各群10頭ずつ電気生理学的、組織形態学的評価を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

神経誘導管移植後12週の電気生理、組織形態学的データはほぼ渉猟しており現在解析中である。24週分の神経誘導管移植、および自家神経移植の動物実験はほぼ終了しており、平成30年５月ごろより動物をsacrificeし、データを取る予定である。
また免疫染色の手技も安定化してきている。今後24週データの解析と抗laminin抗体免疫染色で脱細胞化同種神経基底膜内に残存する細胞外マトリックス，抗S100抗体免疫染色を用いた移植骨髄間葉系幹細胞の神経誘導管内でのSchwann cell様細胞への分化、抗CD8抗体免疫染色により同種神経基底膜の拒絶反応、anti-rat endothelial cell cytoplasmic antigen (RECA-1) antibodyを用いた免疫染色で、20mm欠損長を架橋した同種神経基底膜の再血行化について、評価する予定である。

Strategy for Future Research Activity

1. 電気生理学的、組織形態学的検索：平成30年5月に、術後24週間後のC群, A群のラットを屠殺し、電気生理学的検索と組織形態学的検索を行う。
2. 移植骨髄間葉系幹細胞のSchwann cell様細胞への分化に関する検討：神経誘導管内に移植した骨髄間葉系幹細胞が、Schwann細胞様に分化しているかを検索するため、GFP(+)Lewis ratより採取した骨髄間葉系幹細胞をGFP(-)Lewis ratの神経誘導管内に移植し、再生神経切片をS100, GFAPで免疫染色をおこない、GFPの信号とmergeする細胞があるか検索する。
3. 同種神経基底膜の細胞外マトリックスの存在に対する検索：化学処理により作成した同種神経基底膜にextra cellular componentであるlaminineが残存しているか抗laminine抗体を用いて検索する。
4. 同種神経基底膜の抗原性についての検索：移植された同種神経移植片に拒絶反応が起こっていないかを調べるため、CD8a monoclonal antibodyを用いて免疫染色行い、C群の再生神経片、自家神経移植片、同種神経移植片と比較検討する。
5. 同種神経基底膜の血行化についての検索：本実験では、20mmの坐骨神経欠損を、血管茎を外付けした神経誘導管で架橋しており、外付けの血管茎より神経誘導管内に移植された同種神経基底膜が血行化されているかを、anti-rat endothelial cell cytoplasmic antigen (RECA-1) antibodyを用いた免疫染色を行い検討する。

Causes of Carryover

1.実験前の想定より、スムースに実験が進行し、技術的未熟さに伴う実験動物、試薬費用が少なく済んだ。 2.GFP陽性Lewisラットより採取した骨髄間葉系幹細胞を、GFP陰性Lewisラットの神経誘導管内に移植し、移植した骨髄間葉系幹細胞が再生神経内に存在することを確かめ、かつS100, GFAP免疫染色とマージさせて、移植した細胞がSchwann細胞様細胞に分化する化を確かめる実験を平成30年度に繰り越したため、実験費用が予算より下回った。3.国際学会、国内学会の出張旅費が予算を下回った。4.実験室内に残っていた試薬を使用することができて、購入試薬費用が予算額を下回った。
以上の理由で平成29年度の執行額は予算額を下回ったが、平成30年度に高額な抗体を用いる免疫染色実験を多数予定しており、平成29年度未使用額は、平成30年
度に使用する予定である。