2018 Fiscal Year Research-status Report
Autophagy regulation for inhibition of metastasis in bone and soft tissue sarcoma
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17K10961
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
安田 剛敏 富山大学, 附属病院, 講師 (20377302)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金森 昌彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (20204547)
鈴木 賀代 富山大学, 附属病院, 診療助手 (20456388)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨軟部腫瘍 / オートファジー / 転移 / プログラム死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プログラム細胞死の一つの形態であるオートファジーと肉腫細胞の増殖および転移形成の関連性を把握し、オートファジー調節による新たな肉腫治療薬の臨床応用に向けた基盤研究を行う。転移能の異なるマウス骨肉腫細胞 (Dunn)とマウス軟部肉腫細胞 (RCT)の2種類を用いて実験を行った。Dunnから同一クローンで低肺転移株 (Dunn)と高肺転移株 (LM8)に、RCTから同様に低肺転移株 [RCT(-)]を高肺転移株 [RCT(-)]を分離樹立した。その後、それぞれの細胞の増殖能をMTT assayを施行し、DunnおよびRCTで低肺転移株は高肺転移株と比較し120%の増殖能を示しており、転移形成過程には局所の増殖能のみでは規定されないことが明らかになった。
オートファジー関連蛋白のAtg5に着目し、オートファジー抑制細胞 (shRNA-Agt5)を作成の上、オートファジーが肉腫細胞の増殖能、浸潤能、接着能に及ぼす影響を確認する。In vivoでは、肉腫細胞株の同種同所移植を行い、原発巣、血液循環細胞 (CTC)、転移巣でのオートファジーの状態の差異を把握し、肉腫の転移過程においてどの段階でオートファジーが出現するのかを解明する。オートファジーは原発巣での腫瘍の形成と転移巣の形成に促進的に作用することが確認される。さらに、腫瘍の転移におけるオートファジーの役割は、転移の初期段階である腫瘍細胞の接着能を低下させ、血管内へ浸潤を促進する際のinitiatorであると示される。オートファジーを抑制することで、paxillinの発現抑制を介して、腫瘍細胞の接着能が促進され、原発巣から腫瘍細胞の離脱が制御される。次いで血管内への浸潤能や血管内での移動能を抑制することで転移が抑制されることを示す。
現在、CTCsの採取の手法を確立し、原発巣、CTC及び転移巣でのオートファジーの発現の差異を確認した。今後、オートファジー抑制細胞を用いた同種同所移植により転移が抑制されることを証明する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
RCTの高肺転移株と低肺転移株の転移能の安定化に時間を要したため。
CTC採取の技法の習得に時間を要したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
DunnでのmiRNA arrayを用い、増殖と転移に関与する遺伝子異常を同定する。ついで、in vitroで各肉腫細胞を蛍光色素Monodansylcadaverine (MDC)でオートファジーを発現と割合の検討を行う。すでに、転移能の異なる細胞株は樹立し信用のおけるものとなったため、十分に可能である。さらに、in vitroの結果を踏まえた上で、in vivoでの原発巣、転移巣でのオートファジーの発言の程度と時期に関して検討を深める。
miRNA arrayを用いた発現解析の結果から、オートファジーの調節候補遺伝子またはサイトカインを反応させ、各肉腫細胞の形態変化・機能評価を行う。細胞増殖も含め転移能の評価も行う (前述のごとくすでに対照群の結果はある)。特に形態変化として、オートファジーのマーカーであるMicrotubule-associated protein light chain 3 (LC3)での免疫組織染色で行う。
細胞内シグナル伝達によるオートファジーの調節機能の解明のため、オートファジーを調節する細胞内シグナル伝達をRT-PCRで行う。オートファジーのシグナル伝達として、はAKT/mTOR、SrcやMAPKの経路についても検討を行う。オートファジーの調節する候補遺伝子 (p62など)または増殖因子を反応させた状態での変化の検討を行う。
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| Causes of Carryover |
(理由) 次年度に更なる実験の継続、および研究内容の発表のために必要となった。
(使用計画) 研究費の使用内訳は、①免疫組織化学染色、PCR、フローサイトメトリーに必要な試薬の購入、②研究成果の発表に必要な経費である。③また、RCTの異なる肺転移能の維持のため、C3H/Heマウスを購入、飼育を継続にも使用する予定である。
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