2017 Fiscal Year Research-status Report

Multimodal therapy by microRNA-encoding oncolytic virus

Research Project

Project/Area Number	17K10970
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	久保忠彦広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 准教授 (70397959)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	安達伸生広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 教授 (30294383) 古田太輔広島大学, 病院(医), 助教 (30781645) 坂口剛正広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 教授 (70196070)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	骨肉腫 / microRNA / 腫瘍溶解性ウイルス
Outline of Annual Research Achievements	組換えウイルスの作成：ヒトmicroRNA-34a (NCBIアクセッション・ナンバー：NR029610), microRNA-29a (NR029503), microRNA-143 (NR029684) cDNAをPCRにて増幅作成し、ｌｉｎｋｅｒ insert (NotI/NotI) を介して、VSVゲノムDNA (pVSV-NX2、NC001560) に大腸菌を用いて挿入し，全長のDNAプラスミドを作成する。これをヘルパープラスミドであるpIRES-L，pIRES-N，pIRES-Pと共にT7 RNA polymeraseを発現するHamster腎由来BHK細胞に導入して，組換えウイルスVSV-microRNA-34a,VSV-microRNA-29a,VSV-microRNA-143 を得る。段階的に希釈した後、VSV-microRNAをBHK細胞に感染させ、TCID50法で力価を測定した。VSV-microRNA発現の確認：骨肉腫細胞に感染させてウイルス感染量をreal time RT-PCRにて定量評価した。また、感染された骨肉腫細胞からの各microRNA発現量をRT-PCRにて測定した。現在、VSV-microRNAを感染させた骨肉腫細胞1よりRNAを抽出しノザンブロットにて各種microRNAの発現を確認中である。骨腫瘍マウスの作成：６週齢C3Hマウスの背部に高肺転移性マウス骨肉腫細胞LM8（1 X 107 cells）を移植し、骨肉腫動物モデルを作成する。組換えウイルスによる治療評価：腫瘍径が10mmに達したことを確認後、組換えウイルスVSV-microRNA-34a,VSV-microRNA-29a,VSV-microRNA-143 を投与し、原発巣、転移巣、血中循環腫瘍細胞への効果を評価する。血中循環腫瘍細胞は採取した末梢血から赤血球を除去後、VSV-Katushka (近赤外線蛍光蛋白)にて感染させ集細胞遠心機サイトスピン4で塗抹標本を作製し、蛍光顕微鏡下に細胞数をカウントする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ほぼ当初の計画通り以下を行った。組換えウイルスの作成：ヒトmicroRNA-34a (NCBIアクセッション・ナンバー：NR029610), microRNA-29a (NR029503), microRNA-143 (NR029684) cDNAをPCRにて増幅作成し、ｌｉｎｋｅｒ insert (NotI/NotI) を介して、VSVゲノムDNA (pVSV-NX2、NC001560) に大腸菌を用いて挿入し，全長のDNAプラスミドを作成する。これをヘルパープラスミドであるpIRES-L，pIRES-N，pIRES-Pと共にT7 RNA polymeraseを発現するHamster腎由来BHK細胞に導入して，組換えウイルスVSV-microRNA-34a,VSV-microRNA-29a,VSV-microRNA-143 を得る。段階的に希釈した後、VSV-microRNAをBHK細胞に感染させ、TCID50法で力価を測定した。VSV-microRNA発現の確認：骨肉腫細胞に感染させてウイルス感染量をreal time RT-PCRにて定量評価した。また、感染された骨肉腫細胞からの各microRNA発現量をRT-PCRにて測定した。
Strategy for Future Research Activity	目的通り動物実験を行う予定。骨腫瘍マウスの作成：６週齢C3Hマウスの背部に高肺転移性マウス骨肉腫細胞LM8（1 X 107 cells）を移植し、骨肉腫動物モデルを作成する。組換えウイルスによる治療評価：腫瘍径が10mmに達したことを確認後、組換えウイルスVSV-microRNA-34a,VSV-microRNA-29a,VSV-microRNA-143 を投与し、原発巣、転移巣、血中循環腫瘍細胞への効果を評価する。
Causes of Carryover	一部、予定した消耗品を本年度に回したため。また、海外発表予定であったが、アクセプトされず、本年度の発表数を増やす予定。